内参基因对TYR、MITF和ASIP基因在白绒乌骨鸡各组织表达水平的影响

郑嫩珠，李丽，辛清武，缪中纬，朱志明，刘凤辉，吴俭飞，卢立志

（1．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2．福建省莆田市荔城区畜牧站，福建莆田351100；3．浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021）

内参基因对TYR、MITF和ASIP基因在白绒乌骨鸡各组织表达水平的影响

郑嫩珠1，李丽1，辛清武1，缪中纬1，朱志明1，刘凤辉2，吴俭飞2，卢立志3＊

（1．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2．福建省莆田市荔城区畜牧站，福建莆田351100；3．浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021）

以健康白绒乌骨鸡肌肉、肾、肝、肌胃和皮肤为试验素材，应用实时荧光定量聚合酶链反应技术探讨β－肌动蛋白（beta－actin，ACTB）、3－磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）和18S核糖体RNA（18Sribosomal RNA，18SrRNA）3个内参基因的组织表达稳定性及其对酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、小眼畸形相关转录因子（microphthalmia－associated transcription factor，MITF）和刺鼠信号蛋白（agouti signaling protein，ASIP）等目的基因在白绒乌骨鸡各组织表达水平的影响，并采用紫外分光光度法分析各组织黑色素沉积规律，从中筛选出理想的内参基因．geNorm和NormFinder软件分析结果显示，内参基因GAPDH在白绒乌骨鸡各组织表达稳定性最高，ACTB表达稳定性最低．相对定量和黑色素沉积结果表明，GAPDH作为内参基因时，各组织MITF、TYR基因的相对表达量与黑色素沉积规律基本一致，表现为皮肤＞肾＞肌胃＞肝＞肌肉；ASIP基因的相对表达量与黑色素沉积规律正好相反，表现为肌肉＞肝＞肌胃＞肾＞皮肤，这与各目的基因对黑色素沉积的调控功能相符，即MITF和TYR基因高表达有利于黑色素沉积，ASIP基因高表达则抑制黑色素沉积．而18SrRNA和ACTB作为内参基因时，各目的基因表达量未表现出上述规律，与其各自对黑色素沉积的调控功能不相吻合，没有达到理想的校正效果．表明GAPDH基因稳定性最好，且能真正体现目的基因对黑色素沉积的表达调控，是校正目的基因在白绒乌骨鸡不同组织中mRNA表达量的最优内参基因．

白绒乌骨鸡；内参基因；基因表达；实时荧光定量聚合酶链反应；黑色素沉积

Journal of Zhejiang University（Agric．＆Life Sci．），2015，41（6）：732－740

SummarySilky Fowl is a precious local breed containing a large amount of melanin．Therefore，it is considered to have high edible and medicinal value．Study on the related gene expression is helpful to reveal the internalregulation mechanism of melanin deposition．TYR（tyrosinase），MITF（microphthalmia－associated transcription factor）and ASIP（agouti signaling protein）are important candidate genes for the formation of pigment．Real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（RT－qPCR）has been widely applied to analyze gene expression as a convenient approach，and the selection of appropriate reference genes according to specific samples or conditions is critical to ensure the accuracy and reliability of gene expression．

The objectives of this study are to screen the ideal reference genes and to provide a necessary basis for further study on gene expression regulation of melanin deposition and other important traits in Silky Fowl through investigating the expression stability of reference genes（ACTB，GAPDHand 18S rRNA）and their effects on the expression of melanin genes（TYR，MITFand ASIP）in tissues of Silky Fowl．

RT－qPCR was adopted to investigate mRNA expression levels of the related genes in the muscle，kidney，liver，gizzard and skin of Silky Fowl，and the ultraviolet spectrophotometry was used to measure the melanin content in tissues of Silky Fowl．GeNorm and NormFinder softwares were applied to evaluate the expression stability of reference genes，and 2－△△CTmethod was applied to calculate the relative expression of target gene．

The results from RT－qPCR showed that the melting curve displayed an obvious single peak and standard curves had good linear relationship．Comprehensive evaluation of geNorm and NormFinder indicated that the expression stability of GAPDHwas the highest，while ACTBwas the lowest among the three reference genes in tissues．Relative quantity and melanin content analysis demonstrated that taking GAPDHas a reference gene，the expression level of TYR，ASIPand MITFgenes with the melanin content in tissues had the same trend：skin＞kidney＞gizzard＞liver＞muscle，but the expression level of ASIPgene was opposite to melanin deposition content，which implied that each target gene expression was matched with their respective function on regulating melanin deposition．For instance，high expression of TYRand MITFgenes promoted melanin deposition，while the ASIPgene inhibited melanin deposition．Taking 18S rRNAand ACTBas reference genes，the expression of TYR，MITFand ASIPgenes were not related to the melanin deposition，and an ideal calibration result could not be obtained．

In conclusion，reference gene plays an important role in the expression of target gene．In this paper，GAPDH gene not only had highest expression stability in tissues，but also could truly reflect the regulation effect of the target genes（TYR，MITFand ASIP）on melanin deposition．Thus，GAPDHgene is the most suitable reference gene for normalizing the mRNA expression of genes in tissues of Silky Fowl．

实时荧光定量聚合酶链反应（real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT－qPCR）具有灵敏度高、特异性强、重复性好、准确性高等优点，已被广泛应用于基因表达研究中［1－2］．在利用RT－qPCR分析目的基因的表达水平时，通常需要引入合适的内参基因进行校正和标准化，以期消除不同样本在RNA提取、反转录和PCR扩增效率上可能存在的差别［3－5］．目前，β－肌动蛋白（betaactin，ACTB）、3－磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、18S核糖体RNA（18Sribosomal RNA，18SrRNA）基因等常用来作为内参基因．但由于内参基因的表达具有物种和组织特异性［6］，因此需根据不同样本类型和试验条件选择合适的内参基因．

白绒乌骨鸡作为我国珍贵的地方品种资源，以黑皮、黑骨、黑肉、黑内脏等黑色素性状显著区别于其他普通鸡，因体内含有大量的黑色素，使其具有极高的滋补与药用价值，且颜色愈深，药效愈好［7－8］．研究白绒乌骨鸡黑色素相关基因表达对其黑色素沉积的影响有助于揭示白绒乌骨鸡体内黑色素沉积的内在调控机制，而内参基因的选择对各基因能否真实表达至关重要．目前关于白绒乌骨鸡内参基因的筛选及其黑色素相关基因在白绒乌骨鸡各组织中表达水平的影响还未见报道．因此，本研究拟以ACTB、GAPDH和18SrRNA作为候选内参基因和白绒乌骨鸡肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤组织作为试验素材，利用RT－qPCR技术分析3个内参基因的组织表达稳定性及其对酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、小眼畸形相关转录因子（microphthalmia－associated transcription factor，MITF）和刺鼠信号蛋白（agouti signaling protein，ASIP）等黑色素相关基因在白绒乌骨鸡各组织中表达水平的影响，以及使用紫外分光光度法探测各组织黑色素沉积规律，旨在筛选出稳定性好且能真正体现白绒乌骨鸡组织基因特异性表达的内参基因，为深入研究白绒乌骨鸡黑色素沉积以及其他重要性状基因的表达调控奠定基础．

1 材料与方法

1．1 试验动物和组织采集

从150日龄白绒乌骨鸡中挑选出生长发育良好的16只鸡，公母各半，颈动脉放血后，取其肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤等组织，置于液氮中速冻，－80℃保存待用．

1．2 总RNA提取和反转录

采用总RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，然后用脱氧核糖核酸酶Ⅰ（TaKaRa公司，日本）消化处理，Nanodrop 2000紫外分光光度计检测其浓度和纯度，最后将其质量浓度调整至1μg／μL．从各样品中取出2μg总RNA，利用Oligo（dT）18和SuperScriptTMⅡ反转录酶（Invitrogen公司，美国）将其反转录成cDNA，－20℃保存待用．

1．3 引物合成和质量检测

根据GenBank上已公布的鸡TYR、MITF、ASIP、ACTB、GAPDH和18S rRNA基因序列设计定量PCR引物（表1）．以皮肤组织cDNA为模板，利用所设计的引物进行常规PCR扩增．PCR反应体系（20μL）：cDNA 1．5μL、10×缓冲液2．0μL、

2．5μmol／L dNTPs 1．6μL、5U／μL TaKaRa Taq 0．2μL、10μmol／L特异上下游引物各0．5μL，加ddH2O至20μL．PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30 s，32个循环；72℃延伸8min；4℃保存．PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳检测．

表1 RT－qPCR引物主要信息Table 1 Main information of RT－qPCR primers

1．4 各基因的RT－qPCR检测

利用RT－qPCR方法和所设计的定量PCR引物（表1）检测白绒乌骨鸡肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤等5个组织中ACTB、GAPDH、18S rRNA、TYR、MITF和ASIP基因的mRNA表达情况，反应体系（25μL）：模板cDNA 1．0μL，2×Power SYBR?Master Mix 12．5μL，10μmol／L PCR－F 0．5μL，10μmol／L PCRR 0．5μL，ddH2O 10．5μL．每个样品重复3次．反应条件：95℃1min；95℃10s，64℃25s（收集荧光），40个循环；熔点曲线分析温度55～95℃．

1．5 各组织黑色素含量测定

参照Ozeki等［9］和黎观红等［10］的紫外分光光度法测定白绒乌骨鸡各组织中黑色素含量．将10 mg组织样品加入到1mL溶解液 ［V（助溶剂（soluene－350））∶V（水）＝9∶1］中，100℃水浴加热45min～1h，待组织彻底溶解后立即用Nanodrop 2000紫外分光光度计测定其在500nm处的吸光度值，以D（500nm）表示各样品的黑色素含量．每个样品重复测定5次．

1．6 数据处理与分析

利用geNorm软件（https：／／genorm．cmgg．be／）和NormFinder软件（http：／／www．mdl．dk／publicationsnormfinder．hfm）对各个内参基因的表达稳定性进行统计学分析．采用2－△△CT（CT为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）方法计算各目的基因的相对表达量［11－12］．

2 结果与分析

2．1 各基因的引物PCR扩增检测结果

各基因的引物PCR扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳检测表明，扩增产物特异性明显（图1），且长度与预期相符．说明所设计的引物可作为RT－qPCR的引物．

图1 各基因PCR产物扩增片段电泳图Fig．1 Agarose gel electrophoresis of PCR products for thetested genes

图2 白绒乌骨鸡不同组织中3个内参基因的扩增曲线和熔点曲线Fig．2 Amplification and melting curves of three reference genes in different tissues of Silky Fowl

2．2 各内参基因的RT－qPCR分析

以白绒乌骨鸡肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤等5个组织合成的cDNA为模板进行RT－qPCR分析．结果（图2）显示，3个内参基因的熔解曲线均只存在一个明显的峰值．说明扩增特异性良好，无引物二聚体出现．从3个内参基因的标准曲线（图3）可以看出，回归系数R2均大于0．99，CT值和起始模板浓度对数值均呈良好的线性关系，扩增效率高．因此，可判定该定量结果可信度高．

图3 白绒乌骨鸡不同组织中3个内参基因标准曲线Fig．3 Standard curve of three reference genes in different tissues of Silky Fowl

2．3 各内参基因表达稳定性分析

为筛选理想的内参基因，本试验采用geNorm和NormFinder软件对3个内参基因在白绒乌骨鸡不同组织（肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤）的表达稳定性进行双重评估．由geNorm软件统计结果（图4）可以看出，3个内参基因在组织中的表达稳定性各异，GAPDH、18S rRNA和ACTB的表达稳定平均值依次为1．808、1．922和2．343，即表达稳定性由高到低的顺序为GAPDH＞18SrRNA＞ACTB．由NormFinder软件统计结果（图5）显示，GAPDH和18S rRNA表达稳定值最小，为2．639，表明二者稳定性高．以上2种不同计算方法所得的结果基本一致，即GAPDH稳定性最高，为最优内参基因．

图4 geNorm软件分析3种内参基因在白绒乌骨鸡不同组织中的表达稳定值Fig．4 Expression stability value of reference genes in different tissues of Silky Fowl calculated by geNorm software

图5 NormFinder软件分析内参基因在白绒乌骨鸡不同组织中的表达稳定值Fig．5 Expression stability value of reference genes in different tissues of Silky Fowl calculated by NormFinder software

2．4 各内参基因对TYR、MITF和ASIP基因在白绒乌骨鸡各组织表达水平的影响

利用2－△△CT方法对各目的基因在白绒乌骨鸡各组织中的表达水平进行分析，结果发现各目的基因在各组织中的表达水平因内参基因不同而有所差别．以18S rRNA为内参基因时，MITF和TYR基因组织表达量均表现为皮肤＞肾＞肌肉＞肌胃＞肝，ASIP基因表现为肌肉＞肝＞肌胃＞肾＞皮肤（图6）；以GAPDH为内参基因时，MITF和TYR基因组织表达量均表现为皮肤＞肾＞肌胃＞肝＞肌肉，ASIP基因表现为肌肉＞肝＞肌胃＞肾＞皮肤（图7）；以ACTB为内参基因时，MITF和TYR基因组织表达量均表现为皮肤＞肌肉＞肾＞肝＞肌胃，ASIP基因表现为肌肉＞肝＞肾＞皮肤＞肌胃（图8）．

图6 18S rRNA为内参基因的白绒乌骨鸡不同组织各目的基因相对表达量Fig．6 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under 18S rRNA as reference gene

图7 GAPDH为内参基因的白绒乌骨鸡不同组织各目的基因相对表达量Fig．7 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under GAPDH as reference gene

图8 ACTB为内参基因的白绒乌骨鸡不同组织各目的基因相对表达量Fig．8 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under ACTBas reference gene

2．5 各组织黑色素沉积与不同内参基因各组织目的基因表达关系分析

由图9可知：白绒乌骨鸡体内黑色素含量因组织不同而异，其中以皮肤黑色素含量最高，与其他组织差异有高度统计学意义（P＜0．01），肾次之，肌肉含量最低（P＜0．01）．白绒乌骨鸡各组织黑色素含量表现为皮肤＞肾＞肌胃＞肝＞肌肉．

图9 白绒乌骨鸡各组织黑色素含量测定结果比较Fig．9 Comparison of melanin deposition in different tissues ofSilky Fowl

由以上各组织MITF、TYR和ASIP基因表达特性与黑色素沉积规律可以看出：GAPDH作为内参基因时，各组织MITF和TYR基因相对表达量与黑色素含量顺序相符，ASIP基因相对表达量与黑色素含量顺序相反，这与各基因对黑色素沉积的调控功能相符，即MITF和TYR基因高表达有利于黑色素沉积，ASIP基因高表达则抑制黑色素沉积；而18SrRNA和ACTB作为内参基因时，各目的基因表达量未表现出上述规律，没有真正体现各目的基因对黑色素沉积的调控作用．由此表明，在分析TYR、MITF和ASIP基因在白绒乌骨鸡各组织表达水平时，可以选择GAPDH作为校正内参基因．

3 讨论

RT－qPCR作为一种新型、高效的核酸定量技术，已成为分子生物学中基因功能研究的重要工具［2］．但由于RT－qPCR过程影响因素较多，为获得准确可靠的结果，必须选择表达稳定的内参基因作为校正标准［13］．众多研究表明，真正稳定表达的内参基因并不存在，只是在特定条件下的相对稳定表达［14－16］．因此，根据具体试验材料和条件选择适宜的内参基因对目的基因表达进行校正是RT－qPCR分析中的关键环节．本研究从白绒乌骨鸡不同组织（肌肉、肾、肝、肌胃、皮肤）3个内参基因的表达结果可以看出：经geNorm软件计算出的3个内参基因表达稳定性依次为GAPDH＞18SrRNA＞ACTB；经NormFinder软件分析得出GAPDH和18S rRNA稳定性高．综合2个软件分析结果表明，GAPDH表达最为稳定，适于校正白绒乌骨鸡各组织目的基因的表达水平．

黑色素性状是白绒乌骨鸡最显著的特征，研究黑色素相关基因表达对白绒乌骨鸡黑色素沉积的影响在研究和实践上均具有重要意义．黑色素的合成是一个复杂的调控系统，由多个基因位点编码产物共同参与调控［17］．MC1R（黑素皮质激素受体l）、TYR、ASIP和MITF是黑色素合成重要的候选基因［18］．在黑色素合成通路中，这4个基因之间存在重要的联系．首先，α－MSH（α－促黑色素激素）与其受体MC1R特异性结合，激活cAMP信号转导通路，继而上调MITF表达，MITF作为中介激活TYR、TYRP－1（酪氨酸相关蛋白1）、TYRP－2（酪氨酸相关蛋白2）等基因的表达，并将cAMP产生的信号传递给限速酶基因TYR，启动黑色素的合成［19－20］．ASIP作为MC1R的拮抗剂，则通过与α－MSH竞争性结合MC1R，从而引起MITF表达水平降低，继而TYR表达受阻，导致真黑素合成减少［21－22］．因此，在某种程度上MITF和TYR具有协同效应，其高表达有助于促进黑色素合成；ASIP则通过拮抗MC1R抑制MITF和TYR表达，导致黑色素合成减少．在本研究中，GAPDH作为内参基因时，MITF和TYR基因在不同组织的相对表达量与黑色素含量顺序相符，均呈现出皮肤＞肾＞肌胃＞肝＞肌肉；ASIP基因表达量则与黑色素含量顺序相反，表现为肌肉＞肝＞肌胃＞肾＞皮肤．由此提示，MITF和TYR高表达有利于白绒乌骨鸡体内黑色素沉积，ASIP高表达则会抑制白绒乌骨鸡体内黑色素沉积，这与前人的研究结果［19－22］相吻合．而18SrRNA和ACTB作为内参基因时，各目的基因表达量与黑色素沉积并不存在任何关系，3个目的基因的表达未能真正体现各自对黑色素的调控功能，没有达到理想的校正效果．由此说明，选择GAPDH作为内参基因能够真正校正各目的基因在白绒乌骨鸡各组织的表达水平．

4 结论

本研究结果提示，内参基因GAPDH在白绒乌骨鸡各组织中的表达最稳定，并且能够真实反映TYR、ASIP和MITF等目的基因在白绒乌骨鸡各组织的特异性表达变化；因此，在校正白绒乌骨鸡不同组织中目的基因的表达量时，内参基因GAPDH为最佳选择．这为后续研究白绒乌骨鸡重要功能基因的定量表达提供了重要的参考依据．

（References）：

［1］ Bustin S A，Benes V，Garson J A，et al．The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative real－time PCR experiments．Clinical Chemistry，2009，55（4）：611－622．

［2］ Kheirelseid E A，Chang K H，Newell J，et al．Identification of endogenous control genes for normalization of real－time quantitative PCR data in colorectal cancer．BMC Molecular Biology，2010，11：12－25．

［3］ Cruz F，Kalaoun S，Nobile P，et al．Evaluation of coffee reference genes for relative expression studies by quantitative real－time RT－PCR．Molecular Breeding，2009，23（4）：607－616．

［4］ Hugger J，Dheda K，Bustin S A，et al．Real－time RT－PCR normalisation：Strategies and considerations．Genes ＆Immunity，2005，6（4）：279－284．

［5］ Pfaffl M W，Tichopad A，Prgomet C，et al．Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes，and sample integrity：BestKeeper－Excel－based tool using pair－wise correlations．Biotechnology Letters，2004，26（6）：509－515．

［6］ 董恩妮，梁青，李利，等．实时荧光定量PCR内参基因的选择．中国畜牧杂志，2013，49（11）：93－96．Dong E N，Liang Q，Li L，et al．The selection of reference gene in real－time quantitative reverse transcription PCR．China Journal of Animal Science，2013，49（11）：93－96．（in Chinese with English abstract）

［7］ 伍革民，柳小春，娄义洲，等．δ差异显示筛选武定乌骨鸡“乌色＂性状相关基因．遗传学报，2005，32（1）：30－37．Wu G M，Liu X C，Lou Y Z，et al．Screening genes related to‘black’character in Wu－ding chicken by delta differential display．Acta Genetica Sinica，2005，32（1）：30－37．（in Chinese with English abstract）

［8］ 李瑞成，尚永彪，管俊峰．乌骨鸡黑色素及其研究进展．肉类研究，2010（10）：54－59．Li R C，Shang Y B，Guan J F．Research on melanin from black－bone Silky Fowl．Meat Research，2010（10）：54－59．（in Chinese with English abstract）

［9］ Ozeki H，Ito S，Wakamatsu K，et al．Spectrophotometric characterization of eumelanin and pheomelanin in hair．Pigment Cell Research，1996，9（5）：265－270．

［10］ 黎观红，徐海燕，许兰姣，等．日粮硒添加水平对泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响．中国农业科学，2011，44（13）：2777－2786．Li G H，Xu H Y，Xu L J，et al．Effects of dietary selenium supplementation on growth performance and melanin content in tissues of Taihe Silky Fowls．Scientia Agricultura Sinica，2011，44（13）：2777－2786．（in Chinese with English abstract）

［11］ Price E P，Dale J L，Cook J M，et al．Development and validation of Burkholderiapseudomallei－specific real－time PCR assays for clinical，environmental or forensic detection applications．PLoS ONE，2012，7（5）：e37723．

［12］ Sobajima S，Shimer A L，Chadderdon R C，etal．Quantitative analysis of gene expression in a rabbit model of intervertebral disc degeneration by real－time polymerase chain reaction．The Spine Journal，2005，5（1）：14－23．

［13］ 刘金泊，欧静，姚富姣，等．磷化氢诱导下赤拟谷盗实时定量PCR内参基因的筛选．农业生物技术学报，2014，22（2）：257－264．Liu J B，Ou J，Yao F J，et al．Identification of appropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real－time PCR in Tribolium castaneum after exposure to phosphine．Journal of Agricultural Biotechnology，2014，22（2）：257－264．（in Chinese with English abstract）

［14］ Lee P D，Sladek R，Greenwood C M T，etal．Control genes and variability：Absence of ubiquitous reference transcripts in diverse mammalian expression studies．Genome Research，2002，12（2）：292－297．

［15］ Suzuki T，Higgins P J，Crawford D R．Control selection for RNA quantitation．Biotechniques，2000，29（2）：332－337．

［16］ 孙美莲，王云生，杨冬青，等．茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择．植物学报，2010，45（5）：579－587． Sun M L，Wang Y S，Yang D Q，et al．Reference genes for real－time fluorescence quantitative PCR in Camellia sinensis．Chinese Bulletin of Botany，2010，45（5）：579－587．（in Chinese with English abstract）

［17］ Vachtenheim J，Borovansky J．“Transcription physiology＂of pigment formation in melanocytes：Central role of MITF．Experimental Dermatology，2010，19：617－627．

［18］ 刘甲斐，仇雪．梅黑色素及其相关基因的研究进展．生物技术通报，2007（4）：56－58．Liu J F，Qiu X．Melanin and its relevant gene research progress．Biotechnology Bulletin，2007（4）：56－58．（in Chinese with English abstract）

［19］ Wang Y，Li S M，Huang J，et al．Mutations of TYRand MITFgenes are associated with plumage color phenotypes in geese．Asian－Australasian Journal of Animal Sciences，2014，27（6）：778－783．

［20］ Ito S，Wakamatsu K，Ozeki H．Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis．Pigment Cell Research，2000，13（Supplement 8）：103－109．

［21］ Virador V M，Santis C，Furumura M，et al．Bioactive motifs of agouti signal protein．Experimental Cell Research，2000，259（1）：54－63．

［22］ Hida T，Wakamatsu K，Sviderskaya E V，et al．Agouti protein，mahogunin，and attractin in pheomelanogenesis and melanoblast－like alteration of melanocytes：A cAMP－independent pathway．Pigment Cell ＆Melanoma Research，2009，22（5）：623－634．

Influence of reference genes on expression of TYR，MITFand ASIPgenes in tissues of Silky Fowl．

Zheng Nenzhu1，Li Li1，Xin Qingwu1，Miao Zhongwei1，Zhu Zhiming1，Liu Fenghui2，Wu Jianfei2，Lu Lizhi3＊
（1．Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350013，China；2．Animal Science Station of Licheng District of Putian City in Fujian Province，Putian 351100，Fujian，China；3．Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

Silky Fowl（Gallus gallus domesticus Brisson）；reference gene；gene expression；real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction；melanin deposition

S 831；Q 78

A

10．3785／j．issn．1008－9209．2015．04．131

福建省科技计划（2014R1023－2）；福建省种业创新工程项目（FJZZZY－1504）；浙江省重大科技专项（2014C02001）．

卢立志（http：／／orcid．org／0000－0001－9701－131X），Tel：＋86－571－86406682，E－mail：lulizhibox＠163．com

联系方式：郑嫩珠（http：／／orcid．org／0000－0003－4207－7383），E－mail：zhengnz＠163．com

2015－04－13；接受日期（Accepted）：2015－09－01；< class="emphasis_bold">网络出版日期

日期（Published online）：2015－11－18

URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／33．1247．s．20151118．1640．002．html