脂肪间充质干细胞移植治疗兔耳静脉淤血皮瓣的实验研究

徐 楠， 孙 强， 王晨超， 金石峰， 王 迪， 郭 澍， 王玉新

脂肪移植与研究

脂肪间充质干细胞移植治疗兔耳静脉淤血皮瓣的实验研究

徐 楠， 孙 强， 王晨超， 金石峰， 王 迪， 郭 澍， 王玉新

目的 观察脂肪间充质干细胞移植对兔耳静脉淤血皮瓣的治疗效果。方法 分离兔脂肪间充质干细胞并采用流式细胞术鉴定CD90、CD29、CD31、CD34、CD45以及CD13的表达；建立兔耳静脉淤血皮瓣模型，治疗组给予脂肪间充质干细胞原位注射治疗，对照组给予细胞培养液，于术后7 d切取治疗组及对照组的皮瓣组织，观察皮瓣成活情况并计算成活率；HE染色比较两组皮瓣的病理改变并计数微血管数目；免疫组化检测两组皮瓣组织中VEGF的表达情况。结果 所分离的脂肪间充质干细胞CD90、CD29、CD13表达阳性，而CD31、CD34以及CD45呈阴性表达；造模7 d后，对照组仍可见明显的肿胀及淤血坏死且静脉内存在血栓，而治疗组坏死面积明显缩小，血栓程度减轻且可见新血管的形成，皮瓣成活率以及微血管密度均显著高于对照组(P<0.05);此外，治疗组VEGF的水平也高于对照组。结论 脂肪间充质干细胞移植能够促进皮瓣内VEGF的分泌，促进新血管的形成, 从而改善静脉淤血，提高皮瓣的成活率。

静脉淤血皮瓣； 脂肪间充质干细胞； 皮瓣成活；VEGF

脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells， ADSCs)具有较强的血管再生能力，在创面的修复中取得了良好的应用效果[1]，但其在静脉淤血皮瓣中的作用，还未见明确报道。本研究拟探讨ADSCs移植在兔耳静脉淤血皮瓣治疗中的作用，以期为静脉淤血皮瓣的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康4个月龄新西兰大耳白兔15只(购自中国医科大学实验动物部)，雄性，体质量(3.00±0.21) kg,平均3 kg。于实验室标准环境下分笼饲养，自由进食与饮水，适应性饲养1周后进行实验。实验动物的养护与处置均在获得中国医科大学实验动物伦理委员会的批准后进行。

1.2 兔ADSCs的分离培养与鉴定 以3%戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下切取腹股沟处皮下脂肪组织，PBS洗涤，除去脂肪膜组织和血管。采用胶原酶单独消化法分离ADSCs[2]，将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×2 mm的碎块，置于35 mm培养皿中，加入4 ml 0.1%Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃水浴摇床中消化40 min，加入等体积的PBS终止反应。200目尼龙筛网过滤细胞，离心弃去脂肪层及上清液。PBS洗涤细胞，加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，制成单细胞悬液接种于25 cm2细胞培养瓶内，置于常规细胞培养箱中培养，24 h后弃去未贴壁细胞。36 h后全量换液，之后隔天换液。选择传至第3代的细胞，分别加入CD90、CD29、CD31、CD34、CD45以及CD13抗体，37 ℃避光孵育30 min，于流式细胞仪上进行表面抗原鉴定。

1.3 ADSCs的成脂诱导及鉴定 选择传至第3代的ADSCs，调整细胞密度至1×106/ml，接种于6孔板，待细胞长至70%融合时更换为成脂诱导培养液，诱导3 d；换液为成脂维持液继续培养3 d，循环诱导3次；诱导结束后PBS洗涤细胞3次，加入4%多聚甲醛固定30 min；自来水冲洗3次，加入0.6%油红O染料，室温染色1 h；弃去染色液，清水冲洗3次，显微镜下观察鉴定。

1.4 ADSCs的成骨诱导及鉴定 选择传至第3代的ADSCs，调整细胞密度至1×106/ml接种于6孔板，待细胞长至70%融合时更换为成骨诱导培养液，2 d换液1次，成骨诱导第21天时PBS洗涤细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，同时将在10% 胎牛血清的DMEM培养基中培养的正常细胞作为对照，自来水冲洗3 次，加入1%茜素红染液，室温染色40 min，弃去染液，清水冲洗3次，显微镜下观察拍照。

1.5 静脉淤血皮瓣模型的建立及ADSCs移植 选择健康新西兰大耳白兔12只，随机分为2组。参考Miyawaki等[1,3]方法，建立兔耳静脉淤血皮瓣模型，以2%戊巴比妥钠行右耳静脉注射麻醉，在左耳背部软骨表面，切取3 cm×6 cm，包含皮肤及皮下筋膜层的轴型皮瓣；保留包含耳中央血管和神经的蒂。放大镜下切断并结扎蒂部软组织中的旁支静脉，制成以耳中心动脉为唯一血供，蒂部为唯一静脉回流的轴型皮瓣，5-0缝合线原位缝合皮瓣。治疗组术后沿皮瓣中轴线每隔1 cm注入等量的ADSCs，共5个点，共注入细胞2×106个，对照组注入等体积的细胞培养液。手术结束后，每日观察记录皮瓣颜色、质地、渗出、表面毛发脱落以及血肿形成情况。

1.6 皮瓣成活面积的测量 术后7 d，采用盲法并根据皮瓣的外观、颜色以及质地等区分成活以及坏死皮瓣，亚甲蓝描画出皮瓣范围以及坏死区域，以硫酸纸临描，用不同颜色标记坏死与成活区域，扫描后采用Image-Pro Plus 4.5软件计算皮瓣成活率。于远端等距离切取各组成活皮瓣全层皮肤组织，置于10%甲醛中固定。

1.7 病理组织学观察 将各组皮瓣组织常规石蜡包埋，纵向制成5 μm厚的切片。按照标准程序进行HE染色，常规脱水、透明、封片后，置于显微镜下观察拍照，随机选取20个视野，采用盲法计数每个标本单位面积内的微小血管数目。

1.8 免疫组化 石蜡切片经梯度乙醇脱蜡至水后,置于抗原修复液中进行热修复。切片架置于0.3%H2O2中，室温封闭20 min，漂洗。滴加正常山羊血清，室温封闭30 min。加入1∶100稀释的VEGF抗体，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗。滴加1∶200倍稀释的生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗。擦干切片，滴加HRP标记的亲和素，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗。DAB显色，显微镜下观察，适时终止。苏木素复染，常规脱水透明后中性树胶封片，于200倍显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 兔ADSCs的获得及鉴定 原代分离的ADSCs接种48h后已大部分贴壁，呈长梭形或多角形(图1a)。首次传代以后，细胞生长速度开始加快，3、4d即可达到80%融合。传至第3代的ADSCs长成明显的长梭形且呈放射状向四周分布(图1b)。流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果显示，ADSCs表面标志物CD90、CD29、CD13表达阳性，而血管内皮细胞标志物CD31、造血干细胞标志物CD34以及内皮细胞标志物CD45表达阴性，表明已排除其他细胞污染，获得了ADSCs。

2.2 兔ADSCs的成脂鉴定 兔ADSCs经第1轮成脂诱导后，胞浆内出现细小的脂肪滴;继续诱导后脂滴逐渐聚集成大的脂肪泡，且细胞逐渐增大，由长梭形转变成多边形或者圆形。经3轮诱导后进行细胞爬片，油红O染色鉴定，结果细胞中可见明显的脂滴(图2a)，而未诱导细胞则无上述变化(图2b)，表明所分离的ADSCs具有分化为脂肪细胞的能力。

2.3 兔ADSCs的成骨鉴定 经成骨诱导液培养后，细胞逐渐缩短，呈短梭形或者趋近于方形，细胞体积逐渐变大，出现不规则的细胞堆积。经茜素红染色后，可观察到细胞内由于钙沉积而形成的红色钙结节(图3a)，而未诱导细胞则无上述变化(图3b)。

2.4ADSCs对静脉淤血皮瓣成活及新血管形成的作用 造模完成后,两组动物的皮瓣组织均出现渗血及肿胀，并且远端形成淤血，颜色暗红。术后7d，大部分对照组皮瓣仍可见明显的肿胀及淤血坏死(图4a)，而治疗组坏死面积均有所缩小(图4b)；统计结果表明，治疗组静脉淤血皮瓣的成活率(48.96±10.10)%显著高于对照组(10.37±2.20)%，其差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色观察显示，对照组毛细血管以及微静脉内存在大量的红细胞聚集，并且静脉内发生血栓(图4c)，而治疗组血栓程度明显减轻，且可观察到新生血管的形成(图4d)；治疗组微血管数目显著高于对照组(P<0.05),分别为(10.9±2.1)条和(6.6±1.9)条。

2.5ADSCs对静脉淤血皮瓣VEGF表达的影响 采用免疫组化检测两组皮瓣组织中VEGF的表达，两组均可见深棕色的VEGF抗原抗体复合物沉积在血管腔周围，且在相同观察条件下,治疗组的细胞胞浆着色颜色明显较深(图5a,b)。

图1ADSCs的鉴定(×200)a.原代细胞接种48hb.第3代ADSCs图2 成脂诱导(油红O染色 ×200)a.诱导组b.未诱导组 图3 成骨诱导(茜素红染色 ×200)a.诱导组b.未诱导组 图4 两组皮瓣大体观察及组织病理a.对照组皮瓣b.治疗组皮瓣c.对照组病理(HE×200)d.治疗组病理(HE×200) 图5 两组皮瓣VEGF表达情况(×400)a.对照组b.治疗组

Fig 1 Identification of ADSCs (×200). a. primary cells at 48 hours. b. ADSCs at 3rd generation. Fig 2 Adipogenic induction (Oil red O ×200). a. induction. b. no induction. Fig 3 Osteogenic induction (alizarin red ×200). a. induction. b. no induction. Fig 4 General observation and pathology of skin flap in 2 groups. a. skin flap of control group. b. skin flap of ADSCs group. c. pathology of control group (HE ×200). d. pathology of ADSCs group (HE ×200). Fig 5 Expression of VEGF in 2 groups (×400). a. control group. b. ADSCs group.

3 讨论

ADSCs具有干细胞的一般特性，但是与骨髓间充质干细胞相比，其又具有来源广泛、获取效率高、体外扩增能力强以及不易衰老等特点，因此，ADSCs已成为细胞移植治疗以及组织再生研究的新热点[4-6]。本研究切取新西兰大耳白兔腹股沟处皮下脂肪组织，采用胶原酶单独消化法分离得到了ADSCs。从形态学上观察，接种48 h后ADSCs伸展为长梭形或多角形，传至第3代以后则长成明显的长梭形并向四周放射状分布，与前人结论一致[5,7]。ADSCs与骨髓间充质干细胞一样，能够表达多数干细胞分子标记物，包括CD13、CD29、CD90、CD44、CD58以及CD166等[8]，另外，检测CD34、CD31、CD45的表达，能够将ADSCs与造血干细胞、血管内皮细胞以及内皮祖细胞进行区分。本研究采用流式细胞术鉴定所分离的ADSCs，其CD90、CD29、CD13表达阳性，而CD31、CD34和CD45表达呈阴性。同时对其进行了成脂和成骨的分化诱导实验，结果表明成功获得了兔ADSCs。

一般情况下，静脉淤血会引起毛细血管数目减少，微血管内血液流动减慢，红细胞聚集并引发血栓，从而影响移植皮瓣的成活率，并可能导致手术的失败[9]。因此，促进新血管的形成，改善皮瓣的微循环成为静脉淤血皮瓣治疗中亟待解决的问题。体外和体内研究均发现，ADSCs不仅能够分化为功能性的血管内皮细胞[10]，还能够分泌细胞外因子，促进新血管的形成[11-12]。有研究表明[13]，将ADSCs移植入大鼠背部随意型皮瓣，其能够促发新血管的形成并提高皮瓣的成活率。本研究将兔ADSCs分点注射于静脉淤血的皮瓣组织中，不仅皮瓣淤血情况得到明显改善，移植皮瓣的成活率显著提高，而且皮瓣组织内微血管数目也明显增多。由此可见，ADSCs能够促进新血管的形成，从而提高静脉淤血皮瓣的成活率。

VEGF为一种强有力的促血管生成因子，能够特异性促进血管内皮细胞的有丝分裂,并且直接参与新生血管的形成[14]。目前，VEGF是已知的活性最高、特异性最强的血管生成因子，能够促进血管内皮细胞的分裂增殖，显著增加血管内皮细胞的寿命以及增加血管的通透性，这些作用均已被大量研究所证实[15]。笔者发现，将ADSCs移植后，静脉淤血皮瓣组织内VEGF的水平明显升高，表明ADSCs能够促进VEGF的分泌，促进新血管的形成，进而提高静脉淤血皮瓣的成活率。

综上所述，在静脉淤血皮瓣中原位移植ADSCs，能够有效地减轻皮瓣淤血，提高静脉淤血皮瓣的成活率，并且这种作用可能与ADSCs促进VEGF的分泌能力有关。因此，ADSCs移植，有望成为促进静脉淤血皮瓣成活的有效手段。

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Effectofadiposederivedmesenchymalstemcellsonthetherapyofskinflapswithvenouscongestioninarabbitmodel

XUNan,SUNQiang,WANGChen-chao,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the effect of adipose derived mesenchymal stem cells (ADSCs) on the therapy of skin flaps with venous congestion in a rabbit model. Methods Rabbit ADSCs were isolated and the expression of CD90, CD29, CD31, CD34, CD45 and CD13 was identified by flow cytometry. Rabbit venous congestion skin flaps model was established and ADSCs was the situ injected into the the experimental group, while the cell culture fluid was injected into the control group. The flaps were cut and survival rate was measured at 7 days after surgery. Pathological changes of the flap tissues were observed by HE staining and the number of microvessels was counted. In addition, the expression of VEGF was detected by immunohistochemistry. Results The expression of CD90, CD29 and CD13 was positive and CD31, CD34 and CD45 was negative in the isolated ADSCs. Obvious swelling, bruising necrosis and venous thrombosis was observed in the flaps of the control group, but necrotic area, thrombus was significantly reduced in the ADSCs group. The flap survival rate and microvessel density of the ADSCs group was increased significantly compared to the control group (P<0.05).Otherwise,theexpressionofVEGFinADSCswasalsoobviouslyhigherthancontrolgroup. Conclusion ADSCs transplantation can promote the secretion of VEGF, ameliorate venous congestion and improve survival of the venous congestion skin flaps.

Skin flaps with venous congestion； ADSCs； Flap survival； VEGF

国家自然科学基金资助项目(51272286)；辽宁省自然科学基金资助项目(20102296) 作者单位：110001 辽宁 沈阳,中国医科大学附属第一医院 整形外科 第一作者：徐 楠(1979-),男,辽宁大连人,主治医师,博士研究生. 通信作者：王玉新,110001,中国医科大学附属第一医院 整形外科,电子信箱:wyx6431@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.002

R

A

1673-7040(2015)02-0068-04

2014-11-22)