黑曲霉生产柠檬酸的控制论模型

韩玲玉，成宝琨，郑小梅，孙际宾，袁景淇

（1上海交通大学自动化系，系统控制与信息处理教育部重点实验室，上海 200240；2中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）

黑曲霉生产柠檬酸的控制论模型

韩玲玉1，成宝琨1，郑小梅2，孙际宾2，袁景淇1

（1上海交通大学自动化系，系统控制与信息处理教育部重点实验室，上海 200240；2中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）

黑曲霉发酵是工业生产柠檬酸的主要途径，研究该过程的动力学模型对更好地理解这一工业微生物的代谢机理有重要意义。基于黑曲霉（Aspergillus niger）柠檬酸发酵过程主要代谢途径的分析，构建了简化的碳代谢网络，建立了胞内物质和酶浓度的平衡模型。引入一阶闭环调节器模型描述发酵初期微生物酶系的建立过程。结合生物反应器模型，给出了重要宏观状态变量（如细胞物质浓度、基质浓度、产物浓度）和胞内酶浓度的动态仿真结果与实验值的对比。

黑曲霉；柠檬酸；控制论；动力学模型；胞内酶浓度；代谢仿真

引　言

黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，是重要的工业微生物，在工业酶制剂、有机酸、异源蛋白等发酵生产过程中应用广泛，其中以黑曲霉生产柠檬酸工业过程为典型代表[1]。全球柠檬酸年产量超过150万吨，99%源自黑曲霉发酵[2-3]。

文献报道的黑曲霉柠檬酸发酵过程模型以宏观动力学模型为主[4-7]。近年来，带有酶系调控机制的控制论模型引起了学术界的关注，因为它提供了集成代谢组学和蛋白组学信息，以描述代谢网络对外界环境变化响应的可能[8-12]。随着代谢工程[13]技术的提升，黑曲霉代谢网络的组学信息不断得到揭示，为控制论模型的应用提供了客观条件。

本文在现有动力学研究基础上，通过黑曲霉柠檬酸发酵过程中主要代谢途径分析[14]，提出黑曲霉柠檬酸发酵过程控制论模型，并拟通过实验加以验证，以使该模型可以比较准确地描述黑曲霉生产柠檬酸的宏观和微观发酵过程，调控黑曲霉发酵过程中关键酶的表达，有提高柠檬酸产量的应用潜力，有助于更好地理解黑曲霉的代谢过程。

1　黑曲霉代谢网络分析

黑曲霉的代谢网络研究近年取得了很大进展，Sun等[15]从黑曲霉基因组学的角度探讨了黑曲霉的代谢特性，建立黑曲霉基因组规（genome-scale）代谢网络；Andersen等[16]整合多种组学及文献信息建立了包括亚细胞定位和运输反应的全细胞代谢网络。上述代谢网络包含了2000余个代谢节点和大量的动力学参数，直接模型化难度较高。本文省略了部分中间代谢产物从而得到简化的黑曲霉柠檬酸发酵过程的代谢网络，见图1。其中，GLU为胞内葡萄糖，PPM代表PPP途径中间代谢物，GLM代表糖酵解途径中间代谢物，CITcy为细胞质中的柠檬酸（区别于线粒体中的柠檬酸），rS为比底物消耗速率，rP为比产物生成速率。将TCA循环的中间代谢物质简化为一个代谢物质，记作TCAM，将丙酮酸、PPP途径中间代谢产物和 TCA循环中间代谢产物作为合成生物物质的前体，记作 M（细胞物质）。图1简化后黑曲霉代谢途径的主要代谢反应和对应酶种类见表1。Torres[17]已将系统生物学理论应用于一个类似的代谢网络，取得了很好的结果。

图1　黑曲霉柠檬酸发酵简化代谢网络Fig.1　Abstracted metabolic network for batch fermentation of Aspergillis niger

根据图1所示黑曲霉生长和柠檬酸合成的主要代谢途径，胞外碳源经糖化酶作用转化为胞内葡萄糖（GLU），经过磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸（G6P）（此代谢途径记为p1，其余具体代谢途径标记见图1），一部分葡萄糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径（PPP），生成核酮糖-5-磷酸（PPM），并最终形成细胞物质，其余大部分葡萄糖-6-磷酸形成糖酵解的最终产物丙酮酸（PYR）[18]。丙酮酸一方面被氧化成乙酰辅酶 A（AcCoA），进入三羧酸循环，另一方面固定二氧化碳生成草酰乙酸（OOA）。柠檬酸经 α-酮戊二酸等（TCAM）回到三羧酸循环的起点草酰乙酸，如此完成了三羧酸循环（TCA）的主体[19]。在此过程中伴随着细胞物质的合成，通过碳基等效处理，认为生物物质主要源自乙酰辅酶A和α-酮戊二酸。同时，能量载体（腺嘌呤核苷三磷酸ATP）和电子载体（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD）不断地生成和消耗，呼吸链的主要作用是使细胞生长和维持过程达到能量和电子平衡。

表1　黑曲霉代谢反应（括号中的系数表示化学计量关系系数）Table 1　Major metabolic reactions in Aspergillis niger

表2　控制变量的数学表达式Table 2　Mathematical forms of control variables

2　模型构建

2.1控制变量

在控制论模型中，有两类控制变量，控制酶合成速率的控制变量记为 u，控制酶活性的控制变量记为 v[20-22]。根据代谢网络每个节点的拓扑结构不同，分为发散代谢节点和收敛代谢节点[23]，发散代谢节点对应的控制变量定义为互补型竞争控制变量，用上角标c标记，收敛代谢节点对应的控制变量定义为替代型控制变量，用上角标s标记[20]。代谢途径 Pa、Pc、Pe、Pf对应的控制变量为互补型控制变量，记为 uc、vc；代谢途径Pb、Pd对应的控制变量为替代型控制变量，记为 us、vs。控制变量的数学描述见表2。

2.2动力学模型

根据动态物质平衡，胞内主要代谢物的浓度变化率为

式中，C、S、v的具体描述分别见式（3）～（5），黑曲霉对葡萄糖的比底物消耗速率Sr采用 Monod模型描述

但是在实际发酵过程的初期，菌体会自主诱导相关的酶系（enzyme pool）。因此引入调节器模型来描述酶系建立过程[24]，见图2。图2中一阶闭环调节器的输入是比底物转运速率最小值或初始值，k1和 k2表征了相关酶系的建立过程对比底物消耗速率过渡过程的影响，模型中引入μ的负反馈考虑的是菌体生长对酶系比浓度的稀释作用，K是低通开关[25]。

图2　黑曲霉比底物消耗速率调节器模型Fig.2　Diagram of extended regulator model

调节器模型的数学描述见式（6）

反应速率r1～r10采用Monod模型描述

胞内酶浓度的浓度变化为

其中

2.3宏观状态变量

根据物料守恒定律及微生物反应动力学原理分别可得出下列模型。

（1）菌体生长模型

式中，µ是细胞的比生长速率。

（2）底物消耗模型

（3）产物生成模型

式中，Pr为比产物生成速率。在发酵初期，柠檬酸积累较少，随着黑曲霉的生长，胞外pH降低，柠檬酸开始快速积累[21]，表现为与菌体生长和浓度相关联

3　模型验证

模型验证数据为某柠檬酸工业发酵过程数据，底物和产物测定采用高效液相色谱法（HPLC）。

图3　宏观状态变量的模型仿真结果与测量值的对比Fig.3　Comparison between model simulation and measurements

图4　胞内酶浓度的模型仿真结果与测量值Fig.4　Specific intracellular enzyme levels

模型中共有78个参数，其中7个敏感参数通过差分进化算法进行辨识，结果见表3。其余71个相对不敏感的参数均从文献中查阅得到[3,26-31]。图3和图4是模型仿真结果与实测值对比，图中横坐标为发酵时间。

表3　参数辨识结果Table 3　Identified model parameters

由图3和图4可知，模型可以较好地描述发酵过程中黑曲霉浓度的变化，并与底物和产物的实测数据相吻合。胞内酶浓度变化显示，在发酵初期，经酶系诱导，各代谢途径通量快速上升，在产酸期，糖酵解途径维持较高水平，三羧酸循环受到明显抑制，二氧化碳固定作用明显，从而形成了柠檬酸的积累。

4　结　论

本文分析了黑曲霉代谢途径，建立了柠檬酸发酵过程控制论模型，该模型可以较准确地描述黑曲霉生长、底物消耗、产物生成，同时胞内酶浓度的仿真结果展示了发酵过程中柠檬酸的积累机制，可结合组学信息用于解析柠檬酸高产机理。

符号说明

Ci——中间代谢物的比浓度，g·(g DW)-1

e1～e12——与通路p1～p12对应的胞内酶浓度，

g·(g DW)-1

Kj——反应1～12的饱和常数，g·(g DW)-1

KS——底物转运模型中的米氏常数，g·L-1

k1，k2——调节器模型参数，调节转运时间，h-1

P——产物浓度，g·L-1

p1～p12——简化代谢网络中的通路

rP——比产物生成速率，g·(g DW)-1·h-1

rS——比底物消耗速率，g·(g DW)-1·h-1

r1～r12——通路p1～p12的比反应速率，g·(g DW)-1·h-1

S ——发酵液中的底物浓度，g·L-1

uj——控制酶合成速率的控制变量

vj——控制酶活性的控制变量

X ——生物物质浓度，g DW·L-1

Y ——得率系数

α，β ——模型参数

µ ——比生长速率，h-1

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Cybernetic modeling for citric acid fermentation by Aspergillus niger

HAN Lingyu1, CHENG Baokun1, ZHENG Xiaomei2, SUN Jibin2, YUAN Jingqi1
(1Department of Automation, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;2Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

Aspergillus niger fermentation is the main way for the industrial production of citric acid. Modeling of Aspergillus niger from the perspective of cybernetics is significant for better understanding the metabolic behavior of this industrial microorganism. The metabolic pathways in Aspergillus niger during citric acid fermentation are investigated. Based on the simplified metabolic network, a cybernetic model describing the balance of intracellular metabolites and enzyme levels is constructed. Meanwhile, a first-order closed-loop regulator model is used to describe the transient enzyme pool establishment shortly after the inoculation. Combining with the bioreactor model, it is found that model simulations of intracellular enzyme concentrations are in coincidence with the measurements qualitatively, while the macroscopic state variables (biomass concentration, substrate concentrate and product concentrations) agree well with the offline assays.

Aspergillus niger; citric acid; cybernetic; kinetic model; intracellular enzyme concentration; metabolism simulation

date: 2014-12-18.

Prof. YUAN Jingqi, jqyuan@sjtu.edu.cn

supported by the Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology/ Chinese Academy of Science and the Doctoral Program of Higher Education (20110073110018).

10.11949/j.issn.0438-1157.20141879

TP 273

A

0438—1157（2015）11—4534—06

2014-12-18收到初稿，2015-08-09收到修改稿。

联系人：袁景淇。第一作者：韩玲玉（1992—），女，硕士研究生。

中国科学院系统微生物工程重点实验室开放课题；博士学科点专项科研基金项目（20110073110018）。