HPLC-ELSD同时测定柴胡消瘿颗粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、阿魏酸及橙皮苷的含量

周旭，翟延君

(辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600)

·基础研究·

HPLC-ELSD同时测定柴胡消瘿颗粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、阿魏酸及橙皮苷的含量

周旭，翟延君*

(辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600)

目的：建立采用高效液相-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法同时测定柴胡消瘿颗粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷的含量测定方法。方法：色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.01%甲酸水溶液，梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度为60 ℃，雾化气体为高纯氮气，氮气压力为3.0 MPa，Gain 6。结果：5种活性成分实现良好分离，柴胡皂苷a在0.21～1.64 μg线性关系良好，r=0.999 3，平均回收率为102.2%，RSD为1.5%；柴胡皂苷d在0.355～2.840 μg 线性关系良好，r=0.999 0，平均回收率为101.9%，RSD为1.5%；芍药苷在1.20～9.60 μg线性关系良好，r=0.999 5，平均回收率为97.93%，RSD为2.2%；阿魏酸在0.140～1.120 μg线性关系良好，r=0.999 2，平均回收率为98.79%，RSD为2.7%；橙皮苷在1.00～8.00 μg线性关系良好，r=0.999 2，平均回收率为99.9%，RSD为2.6%。结论：该方法简便、准确，重复性好，可为控制柴胡消瘿颗粒的质量提供参考。

柴胡消瘿颗粒；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；芍药苷；阿魏酸；橙皮苷；高效液相-蒸发光散射检测法

柴胡消瘿颗粒为辽宁中医药大学附属医院名老中医经验方，由柴胡、赤芍、当归、陈皮等8味中药组成，方中以君药柴胡作为肝经引经药，疏肝解郁，使肝气得以调达；以赤芍入肝经血分，散瘀敛阴，柔肝止痛；以陈皮疏肝理气，健脾和中。本复方气血兼顾，肝脾同调，软坚散结，活血化瘀，共奏祛邪扶正、标本兼治之功能。目前，柴胡消瘿颗粒未有相关分析方法的文献报道。本试验采用HPLC-ELSD，同时对君药柴胡中有效成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，赤芍中有效成分芍药苷，当归中有效成分阿魏酸以及陈皮中有效成分橙皮苷进行含量测定，能有效控制产品的内在质量，确保用药安全，为完善该制剂质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；G1379A真空脱气机、G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1315A柱温箱、Agilent1200 蒸发光散射检测器，Agilent B04.03化学工作站(美国Agilent公司)；AE-240 电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KH-400DB 超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；DK-98-Ι型电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药

柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、橙皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110777-200507、110778-200506、110736-201136、0773-9910、110721-200211)；柴胡消瘿颗粒由辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心自制，规格为15 g/袋；甲醇(HPLC级，美国赛默飞世尔科技有限公司)；水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.01%甲酸(B)梯度洗脱(0～10 min，15%→30%A；10～15 min，30%→40%A；15～18 min，40%→55%A；18～20 min，55%→60%A)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；蒸发光散射检测器，漂移管温度为60 ℃，雾化气体为高纯氮气，氮气压力3.0 MPa，Gain 6，过滤器3 s。

2.2 对照品溶液制备

精密称取阿魏酸对照品适量，置容量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容，制成质量浓度为0.140 mg·mL-1的溶液；取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷及橙皮苷对照品适量，分别置容量瓶中，加入甲醇定容，分别制成质量浓度为0.205 mg·mL-1的柴胡皂苷a、0.355 mg·mL-1的柴胡皂苷d、1.20 mg·mL-1的芍药苷、1.00 mg·mL-1的橙皮苷溶液。精密吸取上述5种对照品溶液，等比例混合，得混合对照品溶液，备用[1]。

2.3 供试品溶液制备

取柴胡消瘿颗粒1袋，研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含5%氨水的甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用含5%氨水的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，于50 ℃减压蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[2-4]。

2.4 阴性供试品溶液的制备

按处方及工艺制备成不含柴胡的颗粒剂，再按2.3项下方法制备成柴胡阴性供试品溶液，同法制成赤芍、当归及陈皮阴性供试品液，备用。

2.5 测定法

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。由色谱图可知，供试品溶液在与对照品色谱峰相应的位置上具有相同保留时间的色谱峰，阴性供试品溶液无干扰，见图1。

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.柴胡阴性供试品溶液；D.赤芍阴性供试品溶液；E.当归阴性供试品溶液；F.陈皮阴性供试品溶液；1.芍药苷；2.阿魏酸；3.橙皮苷；4.柴胡皂苷a；5柴胡皂苷d。图1 柴胡消瘿颗粒HPLC图

3 结果

3.1 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液5、10、20、30、40 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，进样量(μg)的常数对数值X与色谱峰面积的对数值Y经线性回归，得回归方程：Y柴胡皂苷a=1.243X+9.779，r=0.999 3；Y柴胡皂苷d=1.110X+8.600，r=0.999 0；Y芍药苷=0.941X+7.641，r=0.999 5；Y阿魏酸=1.437X+11.029，r=0.999 2；Y橙皮苷=0.977X+7.397，r=0.999 2。结果柴胡皂苷a在0.205～1.64 μg，柴胡皂苷d在0.355～2.84 μg，芍药苷在1.20～9.60 μg，阿魏酸在0.14～1.21 μg，橙皮苷在1.00～8.00 μg线性关系良好。

3.2 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，

测定各成分的峰面积，分别计算其RSD值，结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷峰面积常用对数的RSD分别为1.6%、2.1%、1.7%、2.6%和2.9%，表明仪器的精密度良好。

3.3 重复性试验

取柴胡消瘿颗粒(批号：20130301)，平行6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，各取5 μL进样，测定各成分峰面积，计算柴胡消瘿颗粒中各待测成分的质量分数和RSD。结果柴胡皂苷a的质量分数为0.012 1 mg·g-1，RSD为2.8%；柴胡皂苷d的质量分数为0.013 8 mg·g-1，RSD为3.1%；芍药苷的质量分数为0.250 mg·g-1，RSD为1.0%；阿魏酸的质量分数为0.017 0 mg·g-1，RSD为1.3%；橙皮苷的质量分数为0.096 8 mg·g-1，RSD为1.9%，表明本法的重复性良好。

3.4 稳定性试验

取柴胡消瘿颗粒(批号：20130401)，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、6、8 h，各取5 μL进样，测定各成分峰面积，结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷峰面积的常用对数的RSD分别为3.6%、3.1%、1.8%、3.0%、3.1%，表明供试品溶液在室温条件下放置8 h内基本稳定。

3.5 加样回收试验

精密称取已知含量的柴胡消瘿颗粒(批号：20130302)1.0 g，平行6份，分别精密加入柴胡皂苷a对照品溶液0.25 mL(质量浓度为0.041 mg·mL-1)、柴胡皂苷d对照品溶液0.20 mL(质量浓度为0.071 mg·mL-1)、芍药苷对照品溶液1.00 mL(质量浓度为0.240 mg·mL-1)、阿魏酸对照品溶液0.50 mL(质量浓度为0.028 mg·mL-1)和橙皮苷对照品溶液0.45 mL(质量浓度为0.200 mg·mL-1)，按2.3项下方法操作，进行定量测定，计算回收率，结果表明该方法的准确度良好。见表1。

3.6 样品测定

按2.3项下供试品溶液制备方法及2.1项下条件，对5批柴胡消瘿颗粒进行含量测定，以回归方程计算各成分质量分数，结果见表2。

表1 加样回收试验结果

表2 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、橙皮苷、阿魏酸的含量(n=5)

4 讨论

4.1 检测器的选择

复方柴胡消瘿颗粒中有效成分芍药苷、阿魏酸、橙皮苷在紫外区有较强的吸收，而柴胡的有效成分柴胡皂a为齐墩果烷型三萜皂苷，分子结构中仅有一个双键，仅有较弱的末端吸收。应用高效液相色谱法测定柴胡皂苷a、d含量的报道较多，检测波长多在210 nm左右。鉴于在利用紫外末端吸收处进行定量分析检测灵敏度低，基线容易发生漂移，严重影响含量测定的准确性，故本试验采用蒸发光散射检测器，灵敏度高，基线平稳，分离度好，能明显减少杂质峰的干扰，出峰时间短，便于操作[5]。

4.2 流动相的选择

柴胡消瘿颗粒为复方制剂，方中成分复杂，干扰成分较多。通过文献查阅[2-4，6-11]，笔者曾分别采用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等流动相系统，分别按不同洗脱方法进行洗脱。结果表明，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸进行梯度洗脱，5种有效成分中芍药苷、橙皮苷峰拖尾较严重，柴胡皂苷不易被洗脱；采用乙腈-醋酸进行梯度洗脱保留时间过长，故笔者选择以乙腈-0.01%甲酸水梯度洗脱，使各色谱峰有效改善拖尾现象，且能达到较快、较好分离。

4.3 提取方法的选择

柴胡消瘿颗粒中君药柴胡有效成分柴胡皂苷a含量较低，在酸性条件下，柴胡皂苷a分子结构中的环氧醚键会开环，转化为具有共轭双键结构的柴胡皂苷b1，所以使用弱碱性溶剂提取柴胡皂苷a[12]。试验中分别以甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇作为提取溶剂，进行超声提取的方法考察，结果发现5%氨水甲醇提取效果最佳；考察了不同提取时间(20、30、40 min)样品中柴胡皂苷a的含量，结果在30～40 min样品中柴胡皂苷a的含量基本不变；考察了不同温度下(45、55、65、75、85 ℃)，2 h内柴胡皂苷a含量的变化情况，结果发现2 h内，在45～55 ℃柴胡皂苷a的含量变化最小[13]。故本试验选用5%氨水甲醇溶液超声30 min，50 ℃回收溶剂的提取方法。

4.4本试验采用HPLC-ELSD同时测定药材中5种有效成分的含量，方法简便易行，结果可靠，可为更好地控制该复方制剂提供依据。

4.5由于阿魏酸是弱有机酸，曾有文献报道其化学稳定性不高，水溶液药物有效期不到2年，见光时分解更快[14]。从测定结果看，不同批次柴胡消瘿颗粒样品中，当归有效成分阿魏酸的含量差别较大，这是否与该制剂贮藏情况有关，有待于进一步试验验证。

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SimultaneousDeterminationofSaikosaponina、Saikosaponind、Paeoniflorin、FerulicAcidandHesperidininChaihuXiaoyingGranulesbyHPLC-ELSD

ZHOUXu，ZHAIYanjun1*

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian，Liaoning116600，China)

Objective：To establish an HPLC-ELSD method for simultaneous determination of saikosaponin a、saikosaponin d、paeoniflorin、ferulic acid and hesperidin in Chaihu Xiaoying Granules.Methods：The chromatographic separation was performed on Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1and column temperature maintained at 25 ℃.Evaporative light scattering detector was used.The drift tube temperature was 60 ℃.The N2gas flow was 3.0 MPa，Gain 6.Results：The five constituents were separated well.The linear range of saikosaponin a was 0.21-1.64 μg，r=0.999 3，average recovery was 102.2%，RSD 1.5%。The linear range of saikosaponin d was 0.355-2.84 μg，r=0.999 0，average recovery was 101.9%，RSD1.5%。The linear range of paeoniflorin was 1.20-9.60 μg，r=0.999 5，average recovery was 97.93%，RSD2.2%。The linear range of ferulic acid was 0.140-1.12 μg，r=0.999 2，average recovery was 98.79%，RSD2.7%。The linear range of hesperidin was1.00-8.00 μg，r=0.999 2，average recovery was 99.9%，RSD2.6%.Conclusion：The method is rapid，simple and accurate，and can be used for quality control of Chaihu Xiaoying Granules.

Chaihu Xiaoying Granules；saikosaponin a；saikosaponin d；paeoniflorin；ferulic acid；hesperidin；HPLC-ELSD

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.009

2014-10-27)

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翟延君，博士，教授，研究方向：中药质量评价；E-mail:lnzyzj@sohu.com