啤酒糟发酵产纤维素酶的条件优化研究

宾冬梅，黄河清涛，伍渡清，易　诚，饶力群

（1.衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南衡阳 421008；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；3.燕京啤酒（衡阳）有限公司，湖南衡阳 421008）

啤酒糟发酵产纤维素酶的条件优化研究

宾冬梅1，黄河清涛2，伍渡清3，易诚1，饶力群2

（1.衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南衡阳 421008；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；3.燕京啤酒（衡阳）有限公司，湖南衡阳 421008）

为优化发酵条件，选择黑曲霉及康氏木霉，以羧甲基纤维素酶活性为指标，通过正交优化试验，优化单一菌种和混和菌种的最佳发酵条件，比较发酵结果。结果表明：黑曲霉在时间为3天，料水比1：1.5，接种量20%，温度34℃的条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为706.427 nkat；康氏木霉在时间为3天，料水比1：1.5，接种量30%，温度34℃的条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为459.230 nkat；混菌发酵中，料水比为1：0.5，混菌接种20%，其中黑曲霉比木霉接种量为6：4，在32℃下培养3天时，纤维素酶活为812.380 nkat。表明混菌发酵效果比单菌种发酵效果更好，所产生的纤维素酶活更高。

啤酒糟；混菌；发酵；纤维素酶

啤酒糟是生产啤酒的主要原料大米、麦芽等经糊化、糖化工艺进行过滤或压滤之后残留的固体物质，主要成分包括蛋白质、纤维组分、维生素、脂肪、矿物质及淀粉［1］等，且含水量大，容易变质。啤酒企业直接作为粗饲料销售，因纤维含量高、适口性差，养殖户不能完全接收［2-5］，不少企业作为废弃物排放，不仅造成资源浪费，甚至产生严重的环境污染［6］。所以实现提高啤酒糟的利用率，是具有重大的经济效益和社会意义。

目前，国内外产纤维素酶的主要菌种是曲酶、木霉等［7-11］，世界上纤维素酶市场中的纤维素酶20%是来自木霉属和曲霉属［12］。本文选择黑曲霉和康氏木霉为菌种，以啤酒糟为基质，考查单菌发酵与混菌发酵对羧甲基纤维素酶活性的影响，为实现提高啤酒糟的利用以及工业化发酵生产的需要提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌种：黑曲霉、康氏木霉，由湖南农业大学生科院实验室提供。

试剂：3，5-二硝基水杨酸（DNS），羧甲基纤维素钠，硝酸钠、葡萄糖、醋酸、苯酚、酒石酸钾钠、氢氧化钠等均为分析纯。

仪器：粗纤维测定仪、马弗炉、恒温培养箱；紫外分光光度计；恒温水浴锅；高温灭菌锅；离心机。

斜面（平板）培养基：麦芽汁琼脂。

种子培养基：10%麸皮浸汁培养基（10g麸皮+ 100g水煮沸20min，过滤后稀释到100m L）。

发酵培养基：250m L三角瓶中装入经处理的啤酒糟和麸皮共30g（采取啤酒槽与麸皮的比例为8∶2）。

1.2实验方法

1.2.1种子制备

将大约150ml种子培养基放置于250ml三角瓶中，于115℃灭菌15min，冷却后接入新鲜成熟黑曲霉（或康氏木霉）斜面孢子（培养约4d）一环，30℃、100r/min摇床中培养3d。

1.2.2 发酵方法

在250ml烧杯中加入发酵培养基30g，然后灭菌，再接入一定量的种子液，在一定温度下培养一段时间，在发酵结束后，称取1g发酵产物，加入10ml 0.5mol/L醋酸缓冲液，30℃浸泡2.5h，过滤。滤液经4000r/min离心15min，上清液为所需的粗纤维素酶液。称取2-3g发酵产物，使用粗纤维测定仪检测粗纤维含量。

1.2.3正交实验

根据微生物生长的影响因素及前期实验结果，分别以康氏木霉、黑曲霉及混菌为发酵菌种，选择发酵时间、料水比、接种量和温度为试验因子，进行四因素三水平的正交优化试验。以酒糟发酵过程中产品纤维素酶酶活为考察指标，进行发酵菌种的选择。

1.4测定方法

1.4.1葡萄糖标准曲线的绘制

取7支25m L比色管，分别加人1.0mg/m L的葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L，补加蒸馏水至2.0m L，加入3.0m LDNS试剂，沸水浴显色10mni，冷却后定容至刻度，摇匀，54Onm波长处测吸光值A，以吸光值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

1.4.2滤纸酶活性（FPA）测定

滤纸酶活（FPA）测定25m L具塞试管底部放人1张M状的新华1号滤纸（1cm∗6cm，50士lmg），加入1.5m Lp H4.6的0.2mol/L的醋酸缓冲液，加人0.5m L适当稀释的酶液，40℃保温60min，加人3.0m LDNS试剂，沸水浴显色10min，冷却后定容，摇匀，54Onm波长测吸光值，以相同条件下，失活的酶液作对照，从标准曲线上查得生成的葡萄糖量。

1.4.3羧甲基纤维素酶活（CMCA）测定

25mL具塞试管中加人2.0mL10g/L的CMCNa溶液（以0.1lmol/L p H4.6的醋酸缓冲液配制），加人0.5m L适当稀释的酶液，40℃保温30mni，其他同滤纸酶活测定。

酶活定义：在40℃条件下，1s内纤维素酶水解滤纸产生1mol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活性单位（kat）。

其中：m为酶分解底物释放的葡萄糖量，μg；N为酶液稀释倍数；V为反应用酶量，g；t为反应时间，min；λ为酶活性，nkat。

2　结果与讨论

2.1单菌发酵正交试验结果

2.1.1黑曲霉单菌发酵效果分析

首先进行黑曲霉单一菌发酵，以发酵时间（A）、含水量（B）、接种量（C）和温度（D）为试验因子，进行四因素三水平的正交优化试验。以酒糟发酵过程中培养基中纤维素酶酶活为考察指标。实验设计见表1，试验结果见表2、表3。

表1　黑曲霉发酵正交试验L9（34）影响因素及水平

表2　黑曲霉L9（34）正交试验纤维素酶活直观分析

表3　黑曲霉L9（34）正交试验纤维素酶活方差分析表

从实验结果可知，在只接种黑曲霉的情况下，影响啤酒糟发酵过程中纤维素酶活的4个因素的主次关系为时间、接种量、料水比、温度。优组合为A3B3C2D3，对该优化组合进行验证，即在时间为3天，料水比1：1.5，接种量20%，温度34℃的条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为706.427 nkat。

2.1.2康氏木霉单菌发酵效果分析

在康氏木霉单菌发酵中，以发酵时间（A）、含水量（B）、接种量（C）和温度（D）为试验因子，进行四因素三水平的正交优化试验。以酒糟发酵过程中产品粗纤维素酶酶活为考察指标。实验设计与黑曲霉单一发酵试验相同见表1，试验结果见表4、表5。

表4　木霉发酵正交试验L9（34）纤维素酶活直观分析

表5　木霉L9（34）正交试验纤维素酶活方差分析表

通过表4、表5可知，在仅接种木霉的情况下，影响啤酒糟发酵过程中纤维素酶活的4个因素的主次关系为时间、接种量、料水比、温度。因最优组合为A3B3C3D3，验证实验表明，在时间为3天，料水比1：1.5，接种量30%，温度34℃的最佳条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为459.230 nkat。略低于黑曲霉单菌发酵产酶效果。

2.2混菌发酵正交试验结果分析

对黑曲霉、木霉进行混菌发酵中，以以发酵时间（A）、含水量（B）、菌种比（C）、接种量（D）和温度（E）为试验因子，进行五因素四水平的正交优化试验。以酒糟发酵过程中产品纤维素酶酶活为考察指标。试验安排、试验结果及试验分析如表6、表7、表8所示。

表6　混菌正交试验L16（45）影响因素及水平

表7　混菌L16（45）正交试验纤维素酶活直观分析

表8　混菌L16（45）正交试验纤维素酶活方差分析表

从表7、表8可看出，在进行混菌试验时，影响啤酒糟发酵过程中纤维素酶活的5个因素的主次关系为温度、料水比、时间、接种量、菌种比。最优组合为A2B2C2D1E3，该组合单独验证实验，当条件为料水比为1：0.5，混菌接种20%，其中黑曲霉比木霉接种量为6：4，在32℃下培养3天时，测量结果为纤维素酶活为812.380 nkat，所产纤维素酶活性最大。

3　结论

为优选一次混菌发酵菌种，以康氏木霉、黑曲霉及混菌为发酵菌种，选择发酵时间、料水比、接种量和温度为试验因子，进行正交优化试验。以酒糟发酵过程中产品纤维素酶酶活为考察指标，比较其纤维素分解能力，结果表明：

黑曲霉在时间为3天，料水比1∶1.5，接种量20%，温度34℃的条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为706.427 nkat。

康氏木霉在时间为3天，料水比1∶1.5，接种量30%，温度34℃的条件下发酵，测量结果为纤维素酶活为459.230 nkat。

混菌发酵中，料水比为1∶0.5，混菌接种20%，其中黑曲霉比木霉接种量为6∶4，在32℃下培养3天时，纤维素酶活为812.380 nkat。

表明混菌发酵效果比单菌种发酵效果更好，所产生的纤维素酶活更高。

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Ideal Growth Conditions for Cellulase Enzymatic Produced Using Brewer＇s Spent Grain Through Fermentation

HUANGHE Qing-tao1，YI Cheng2，WU Du-qing3，BIN Dong-mei2，RAO Li-qun1
（1.College of Life Science and Environment，Hengyang Normal University，Hengyang Hunan 421008，China；2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128，China；3 Yanjing（Hengyang）Beer Company，Hengyang Hunan 421008，China）

To optimize growth conditions，we selected aspergillus niger and trichoderma koningii，and optimized the best fermentation conditions of a single strain and mixed strains based on carboxymethyl cellulose enzyme activity by orthogonal design tests.The results showed that aspergillus niger fermentation optimum conditions of the fermentation time was 3d at 34℃，the ratio of water to material was 1.5：1，and inoculum amount was 20%，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 706.427 nkat.Trichoderma koningii fermentation optimum conditions of the fermentation time were 3d at 34℃，the ratio of water to material was 1.5：1，and inoculum amount was 30%，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 459.230 nkat.The mixed fermentation optimum conditions of the fermentation time were 3d at 32℃，the ratio of water to material was 0.5：1，and inoculum amount was 20%，Aspergillus niger and Trichoderma koningii inoculum amount was 6：4，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 812.380 nkat.It turned out that the effects of mixed fermentation is better than one strain fermentation and the cellulase activity by mixed fermentation is higher.

brewer＇s grains；mixed bacteria；fermentation；cellulase

Q552

A

1673-0313（2015）06-0127-04

2015-09-15

湖南省自然科学基金省市联合基金（编号：14JJ5001）

宾冬梅（1970-），女，湖南衡阳人，教授，硕士生导师，研究方向：农副产品开发与利用。