高产林可霉素链霉菌的筛选及发酵条件的优化

高产林可霉素链霉菌的筛选及发酵条件的优化

邓加聪1，施潇蕊1，曾德样1，张文森2，徐慧诠2，唐慧华2，郑虹1*
（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清350300；2.福建师范大学福清分校朗姆多果酒研究所，福建福清350300）

采用平板划线，摇瓶复筛等方法从福清近海海域泥土中分离筛选到一株林可霉素产率较高的链霉菌株6204；采用单因素试验和正交设计试验，从葡萄糖添加量、磷酸二氢钾条件两及金属离子对菌株6204产林可霉素影响，并对其发酵条件进行优化。结果表明，最适的发酵条件为葡萄糖添加量10.0%，镁离子质量浓度0.10 g/L，磷酸二氢钾添加量0.020%，在此优化发酵条件下，菌株6204产林可霉素的含量可达3 907.738 μg/mL，与优化前相比较，林可霉素的含量提高了1 823.082 μg/mL。

链霉菌；选育；林可霉素；发酵条件；优化

林可霉素是林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis）发酵产生的一类抗生素，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）等革兰氏阳性菌具有较强的拮抗作用。在医药方面，主要用于呼吸道、皮肤及软组织感染等疾病的治疗，由于其疗效稳定、不良反应小、使用安全，作为青霉素的替代药逐渐被应用于临床中［1］。

目前对于产林可链霉菌的研究，国内研究主要集中于菌种选育［2-4］、培养基优化［5-6］，或采用基因工程的方法对产林可菌株进行工程菌的改造［7-10］，以期提高菌株产林可的产量。在菌种选育方面，孟娜等［2］采用硫酸二乙酯和紫外复合诱变方法，得到一株遗传性能良好的突变株，其林可霉素效价可达到4 082 U/mL，比出发菌株提高了107%；李静仁［3］以林可霉素产生菌L92为出发菌株，采用氯化锌、紫外线和硫酸二乙酯三重诱变，获得高产菌株L-96，其摇瓶效价较出发菌株提高了50.2%。在培养基优化方面，薛正莲等［5］采用响应面法对链霉菌SL-98-2-8的发酵培养基进行优化，得到最佳的发酵条件为淀粉2.1%，玉米浆0.33%，葡萄糖8.5%，豆饼粉2.53%，磷酸二氢钾0.022%，在此条件下，林可霉素的含量为3 700 μg/mL，比优化前提高了12%；钟益清［6］通过罐上工艺改进对林可霉素发酵进行研究，使林可霉素的生物效价从无补料的3 851 μg/mL提高到7 421 μg/mL。陈林［7］以链霉菌N9为出发菌，增加林可霉素的甲基化基因orf25、orf12，调控基因orf22或整个生物合成基因簇IE8拷贝数的遗传改造，林可霉素A产量分别提高5.52%、13.75%、6.24%、17.3%。薛正莲等［8］用紫外线和激光对林肯链霉菌原生质体进行复合诱变，得到一株林可霉素高产菌株SL98-2-8-116，其摇瓶效价可达3 629 μg/mL，较出发菌株提高了18.3%。国外学者研究主要在于林可霉素的合成途径，KAMENIK Z等［11］用高效液相色谱对林可霉素发酵过程的中间体进行检测，进而推知跟林可霉素合成有关的关键步骤和中间体，对其进行改进，提高林可霉素的产量。

本研究从福清近海海域泥土中，分离筛选出一株林可霉素产量较高的菌株链霉菌6204，并采用单因素试验及正交试验对其发酵条件进行优化研究，得到该菌株产林可霉素的最适发酵条件，提高链霉菌6204林可霉素的产量，为林可霉素的后期纯化和研究应用提供一定的基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验菌株

链霉菌（Streptomyces）：分离于福清近海海域泥土。

1.1.2化学试剂

玉米浆粉、黄豆饼粉：市售；林可霉素注射液（2 mL/0.6 g）：购自福清永惠医药超市；可溶性淀粉、葡萄糖、硫酸氢二钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化钠等试剂（均为分析纯）：国药集团药业股份有限公司。

1.1.3培养基

平板培养基/斜面培养基：可溶性淀粉20 g/L，KNO31 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5g/L，黄豆饼粉5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，琼脂粉18g/L，pH 7.2～7.3，121℃灭菌15 min。

种子培养基：葡萄糖15 g/L，可溶性淀粉20 g/L，玉米浆粉16 g/L，黄豆饼粉15 g/L，（NH4）2SO41.6 g/L，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

基础发酵培养基：葡萄糖100 g/L，玉米浆粉1 g/L，黄豆饼粉26 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 5 g/L，NaNO38 g/L，CaCO38 g/L，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

1.2仪器与设备

NRY2102C恒温振荡器：上海南荣实验室设备有限公司；LDZX-50BI立式自动电热压力蒸气灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；SPX-150B-2生化培养箱：南京艾赛特科技有限公司；SW-CJ-IFD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；THZ-C台式恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；H1850R高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1链霉菌牛奶冻干管的稀释涂布

称取1 g近海海泥，加入100 mL无菌蒸馏水，静置30 min，充分混匀后，用无菌蒸馏水稀释至梯度为10-2、10-3、10-4，充分混匀后，取0.2 mL稀释液涂布于平板培养基，30℃倒置培养15～20 d，挑取颜色白、菌落大的单菌落，接种于试管斜面，培养后，4℃冰箱保存备用。

1.3.2林可霉素高产菌株的筛选

将挑取到的单菌落接种于试管斜面活化；接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min振荡培养72 h；按10%接种量将种子液接种于装液量为100 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、150 r/min振荡培养96 h，发酵液4℃、8 000 r/min离心5 min，测定上清液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

1.3.3链霉菌6204的活化及种子液的制备

4℃保存的链霉菌6204接种于试管斜面活化；接种于种子培养基，30℃、150 r/min振荡培养72 h。

1.3.4单因素试验

（1）葡萄糖添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响

改变基础发酵培养基中葡萄糖的含量，葡萄糖添加量分别为2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，30℃、150 r/min振荡培养96h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

（2）金属离子对链霉菌6204产林可霉素的影响

在基础发酵培养基中分别添加0.20g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

（3）磷酸二氢钾添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响

在基础发酵培养基中添加不同含量（0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）的磷酸二氢钾，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

1.3.5发酵条件优化正交试验

根据单因素试验结果，以林可霉素含量作为评价指标，采用3因素3水平设计正交试验，其因素与水平见表1。

表1　发酵条件优化正交试验因素与水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6林可霉素含量的测定

采用紫外分光光度法［12-13］测定溶液中林可霉素的含量。林可霉素的含量及相对效价计算公式如下：

2　结果与分析

2.1牛奶冻干管的稀释涂布

将链霉菌牛奶冻干管进行稀释涂布，从分离平板上筛选出17株菌落大且颜色白的单菌落，接种于试管斜面，菌株编号为：6101、6102、6201、6202、6203、6204、6205、6301、6302、6303、6304、6305、6401、6402、6403、6404、6405。

2.2高产林可霉素链霉菌菌株的筛选

将挑取到的单菌落接种于发酵培养基，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液的林可霉素含量并计算其相对效价。结果见图1。

图1　不同菌株产林可霉素的影响Fig.1 Effect of different strains on lincomycin production

由图1可知，不同菌株产林可霉素效价各不相同，其中林可霉素含量最高的菌株是链霉菌6204，该菌株发酵液中林可霉素的含量达2 773.07 μg/mL，相对效价为100%。因此，选用链霉菌6204进行下列的发酵试验。

2.3单因素试验结果

2.3.1葡萄糖添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响

改变基础发酵培养基中葡萄糖的添加量，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。结果见图2。

图2　葡萄糖添加量对菌株产林可霉素的影响Fig.2 Effect of glucose addition on lincomycin production

由图2可知，菌株林可霉素的含量随着葡萄糖添加量的增加呈先增后降的趋势，当葡萄糖添加量为7.5%时，发酵液中林可霉素的含量达到最大，为2 481.48 μg/mL，相对效价119.04%。葡萄糖的添加量过低会影响菌体的生长，而过高又会出现葡萄糖效应，进而影响林可霉素的生产合成。因此，基础发酵培养基中葡萄糖的最适添加量为7.5%。

2.3.2金属离子对链霉菌6204产林可霉素的影响

在基础发酵培养基中加入0.20 g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。结果见图3。

图3　不同的金属离子对菌株产林可霉素的影响Fig.3 Effect of different metal ion on lincomycin production

据文献报道［14-15］，发酵培养基中添加一定量的金属离子，对菌株产林可霉素具有一定的影响。由图3可知，金属离子对菌株产林可霉素的影响顺序如下：Mg2+＞Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+，不添加任何金属离子的对照（CK）组对比，添加有Mg2+、Fe3+、Cu2+的发酵培养基中，林可霉素的相对效价均＞100%，其中添加有Mg2+的发酵培养基中，菌株6204产林可霉素的量可达2 471.56 μg/mL，相对效价为118.56%。与CK相比，林可霉素的产量提高了18.56%。因此，基础发酵培养基中最适添加0.20 g/L金属离子Mg2+。

2.3.3磷酸二氢钾添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响

在基础发酵培养基中加入不同含量的磷酸二氢钾，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。结果见图4。

图4　磷酸二氢钾含量对菌株产林可霉素的影响Fig.4 Effect of KH2PO4addition on lincomycin production

据文献报道［17］，一定含量的磷酸盐会影响菌株林可霉素的合成。由图4可知，林可霉素的含量随着磷酸二氢钾添加量的升高呈先增后降的趋势，当磷酸二氢钾的添加量为0.01%时，发酵液中林可霉素的含量达到最大值，为2 742.725 μg/mL，相对效价达到131.57%。可能是由于在高浓度磷酸盐的环境下，有利于微生物蛋白质的合成，进而延长了菌株的生长期，但由于后期营养不足，使得林可霉素的合成受到影响。因此，基础发酵培养基中磷酸二氢钾的最适添加量为0.01%。

2.4发酵工艺优化正交试验

根据单因素试验结果，以林可霉素含量作为评价指标，进行3因素3水平正交试验，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2　发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3　正交试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，3个因素对林可霉素含量的影响大小分别为磷酸二氢钾添加量＞葡萄糖添加量＞镁离子质量浓度。菌株6204产林可霉素的最佳配比组合为A3B1C3，即葡萄糖添加量10.0%，镁离子质量浓度0.10 g/L，磷酸二氢钾添加量0.020%，在此最佳发酵条件下，菌株6204产林可霉素的量可达3 907.738 μg/mL。

由表3可知，磷酸二氢钾添加量对菌株6204产林可霉素有着极显著（P＜0.01）影响，葡萄糖添加量对菌株6204产林可霉素有着显著（P＜0.05）影响，而镁离子质量浓度对菌株6204产林可霉素影响不显著（P＞0.05）。

3　结论

从福清海域泥土中分离筛选到一株产林可霉素较高的菌株6204，根据单因素试验和正交试验，研究葡萄糖添加量、磷酸二氢钾添加量及金属离子质量浓度对菌株6204产林可霉素的影响，并对其发酵条件进行优化，得到菌株6204产林可霉素的最佳发酵条件，即葡萄糖添加量10.0%，镁离子质量浓度0.10 g/L，磷酸二氢钾含量0.020%，在此最佳发酵条件下，林可霉素的含量可达3 907.738 μg/mL。

［1］贾海艳.庆大-林可霉素的安全毒理学研究［D］.哈尔滨：东北农业大学硕士论文，2010.

［2］孟娜，吴丁柱，李婉珍，等.林可霉素高产菌株的定向选育［J］.发酵科技通讯，2013，42（4）：9-12.

［3］李静仁.林可霉素高产菌株的选育［J］.中国抗生素杂志，2013，38（11）：815-819.

［4］乔现婷.林可霉素高产菌株的选育及代谢过程的调控［D］.上海：华东理工大学硕士论文，2011.

［5］薛正莲，朱艳，张相美，等.响应面法优化林可霉素发酵培养基［J］.中国抗生素杂志，2009，34（5）：277-280.

［6］钟益清.林可霉素中试发酵工艺的优化［D］.南昌：江西师范大学硕士论文，2013.

［7］陈林.遗传改造Streptomyces lincolnensis工业菌提高林可霉素A产量和纯度的初步研究［D］.上海：华东理工大学硕士论文，2011.

［8］薛正莲，王洲，张相美，等.紫外-激光复合诱变原生质体选育林可霉素高产菌株［J］.激光生物学报，2010，19（6）：838-842.

［9］王增亮，赵群飞，高淑红，等.Streptomyces lincolnensis新遗传操作方法的建立以及lmbQ基因功能研究［J］.生物技术通报，2010，220（11）：186-191.

［10］窦会娟，孙连海，李林珂，等.高抑菌活性链霉菌的原生质体制备及诱变选育［J］.中国酿造，2011，30（12）：74-76.

［11］KAMENIK Z，KOPECKY J，MARECKOVA M，et al.HPLC-fluorescence detection method for determination of key intermediaties of the lincomycinbiosynthesisintermentationbroth［J］.Anal Bionanal Chem，2009，393（6-7）：1779-1787.

［12］邵耀东，赵小华，胡彬，等.紫外分光光度法测定盐酸林可霉素注射液中林可霉素含量［J］.黑龙江畜牧畜兽医：科技版，2012，3（5）：89-90.

［13］冯学忠，吴广辉，方炳虎，等.盐酸林可霉素紫外分光光度测定方法的建立［J］.动物医学进展，2009，30（12）：60-63.

［14］项驷文，陶玉贵，孙忆晨，等.氨基酸及金属离子对林肯霉素发酵的影响［J］.安徽工程大学学报，2013，28（2）：49-53.

［15］汤海云，李嘛，储矩，等.金属离子对林可霉素合成的影响［J］.中国抗生素杂志，2007，32（12）：723-726.

［16］LI X B，ZHAO G R，ZHENG H.Improved industrial fermentation of lincomycin by phosphorus feeding［J］.Process Biochem，2007，42（4）：662-668.

Screening ofStreptomycessp.with high-yield lincomycin and its fermentation condition optimization

DENG Jiacong1，SHI Xiaorui1，ZENG Deyang1，ZHANG Wensen2，XU Huiquan2，TANG Huihua2，ZHENG Hong1*
（1.School of Ocean and Biochemical Engineering，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300，China；2.Reseach Institute of Rum Wine，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300，China）

Abastract：Strain 6204 with high-yield lincomycin was isolated and screened from soil of coastal waters by plate streaking and shaking flask.And the fermentation conditions of strain 6204 were studied and optimized by single factor and orthogonal experiment，using glucose addition，potassium dihydrogen phosphate concentration and metal ions as evaluation factors.The results showed that the optimum fermentation conditions were glucose 10.0%，magnesium ion 0.10 g/L，potassium dihydrogen phosphate 0.020%.Under the conditions，the lincomycin concentration produced by strain 6204 could up to 3 907.738 μg/ml，which improved 1 823.082 μg/ml than that before optimization.

Streptomycessp.；screening；lincomycin；fermentation conditions；optimization

TQ925

A

0254-5071（2015）11-0099-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.023

2015-10-15

福建省自然科学基金项目（2015J01132）；福建省教育厅中青年教师项目（JA15569）；福建省中青年教师教育科研项目（JA11285）；福建省科技计划引导性项目（2015N0004）；福建省大学生创新创业基金项目（20422337）

邓加聪（1981-），男，副教授，博士研究生，研究方向为微生物菌株筛选及发酵。

郑虹（1981-），女，实验师，硕士，研究方向为微生物菌株筛选及发酵。