辽宁省黑木耳主栽品种的酯酶同工酶分析

李红等

摘要：采用同工酶电泳技术和传统的拮抗试验对辽宁省10个黑木耳（Auricularia auricular-judae）主栽品种进行了遗传多样性分析。结果表明，在相异水平70%左右时，这10个黑木耳品种可以分为3类。表明辽宁省黑木耳主栽品种间具有不同的亲缘关系，但是部分品种间亲缘关系较近，多态性不强。酯酶同工酶聚类分析结果与拮抗试验结果基本一致。

关键词：黑木耳（Auricularia auricular-judae）；酯酶同工酶；拮抗试验；遗传多样性分析

中图分类号：S646.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4211-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.026

同工酶是一种催化反应相同而结构及理化性质不同的酶的分子类型。虽然不是基因表达的直接产物，但是由于表达的是蛋白质水平上的信息，弥补了传统真菌分类的不足，在一定程度上可以作为菌株遗传背景鉴定的依据，且与形态学分类和现代分子标记分类法相比，具有直观、快速等优点，也是一种常用的化学标记，广泛应用于动、植物等许多学科[1]。目前已有近百种同工酶被应用于真菌的分类鉴定和遗传育种，也广泛应用于黑木耳（Auricularia auricular-judae）交配型的测定、亲缘关系分析、菌种鉴定等方面[2]。

黑木耳是中国最早开始人工栽培的食用菌，具有非常重要的食药用价值，是中国传统出口产品，销往日本、泰国、新加坡、澳大利亚以及西欧、北美、东欧等国家[3]。辽宁省是仅次于黑龙江省和吉林省的黑木耳生产大省，所使用的菌株部分来自野生菌株人工驯化，部分引自黑龙江省、吉林省和其他区域。为了加强辽宁省黑木耳菌种的质量管理体系，需要对辽宁省黑木耳栽培种质资源的遗传多样性进行评价，以便更好地开展黑木耳的良种选育，保护黑木耳新品种知识产权，促进黑木耳产业持续健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黑木耳品种 试验所用黑木耳品种见表1，均为辽宁省的主栽品种。

1.1.2 培养基 加富PDA培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，琼脂2%，维生素B1适量，自来水定容至1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 挑取1 cm2供试黑木耳菌丝在马铃薯固体培养基上活化，置于25 ℃黑暗条件下培养10 d，定期检查有无污染现象，将污染的菌株及时清除，将活化好的、菌丝长势强的菌种用于拮抗试验。

1.2.2 拮抗试验 每个菌种用直径0.6 cm的打孔器打取3个菌丝块，交叉循环，3次重复，在直径9 cm平板上按“品”字形接种活化的菌种。菌株间距3 cm左右，置于25 ℃黑暗条件下培养7 d，观察拮抗线形成情况。

1.2.3 酯酶同工酶鉴定 将活化后的供试菌株转接到加富培养基斜面上，25 ℃避光培养8～14 d，收集长满培养基表面的菌丝0.5 g，加入等量液氮研磨，于4 ℃、10 000 r/min离心20 min。弃去沉淀取上清，置于2 mL离心管中，低温保存备用。

采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。将样品与40%蔗糖1∶1（V/V）混合后点样，加样量30～50 μL，先低压电泳一段时间，待进入分离胶后再加大到所需电压，电泳在0～4 ℃冰箱中进行。电泳完毕后，将胶板从电泳槽上卸下来，置于白磁盘或大培养皿内即可染色和固定，并于4 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 不同菌株间的拮抗反应

拮抗反应实质为体细胞不亲和性（或称为营养不亲和性或异核体不亲和性），因其所表现的外部性状与拮抗相似而被称作拮抗，是一种在同种的遗传型不同的组织接触时防止融合和重组的机制，拮抗线试验又广泛用于丝状真菌种内菌株的鉴定、分类或是否同种异名。不同菌株间的拮抗反应结果见表2。从表2可以看出，M2和M10组合、M4和M32组合、M10和M14组合、M11和M26组合、M13和M23组合均无拮抗反应，亲缘关系非常近或为同物异名；M2和M13、M23、M28组合，M4和M23、M26组合，M13和M14、M26、M28、M32组合，M23和M32组合，M26和M28、M32组合，M28和M32组合有明显拮抗反应，亲缘关系较远，为独立菌株；其他组合有拮抗反应，但是不明显，亲缘关系较近。

2.2 辽宁省黑木耳主栽品种酯酶同工酶的多态性分析

由图1可见，在相同条件下，10个菌株共出现了13条酶带，迁移率为0.073～0.663（El 0.073，E2 0.135，E3 0.337，E4 0.371，E5 0.388，E6 0427，E7 0.455，E8 0.494，E9 0.534，E10 0.573，E11 0.601，E12 0.618，E13 0.663），其中E7、E8、E9是10个菌株共同拥有的3条基础特征酶带，且酶带颜色深，活性强。不同菌株酶带在分布、宽窄、颜色及数量等方面有一定的差异性，M23、M13这2个菌株在Rf=0.57处有一条特异性酶带，颜色较浅，可作为菌株相互区别的鉴定依据。M4、M11、M14、M26这4个菌株在酶带的位置和数量上差异不大，说明这4个菌株亲缘关系较近，只是酶带的颜色有些不同，酶的活力有些差异。而酶带E1、E2、E5、E13均为单个菌株特有的酶带。

2.3 聚类分析

利用DPS数值处理系统软件中的UPGMA计算10个黑木耳菌株酶谱之间的联合系数，并对所得的酶带进行系统聚类分析，聚类分析树状图见图2。结果显示，在相异水平70%左右时，可以把这10个菌株分为3类：第一类包括M2、M4、M11、M26、M28、M32这6个菌株；第二类包括M10菌株和M14菌株；第三类包括M13菌株和M23菌株。M4菌株和M32菌株几乎没有差异，为同物异名。聚类分析结果与形态特征基本趋同。

3 小结

本研究运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和传统的拮抗试验对辽宁省10个黑木耳主栽品种进行遗传多样性分析，结果显示两种方法所得到的结果基本一致：辽宁省黑木耳主栽品种间具有不同亲缘关系，但是部分品种间亲缘关系较近，遗传背景比较一致，可能是由于同一地域的主栽菌株一般由当地野生菌株驯化所得，多态性不强。康达1号和黑威15分别是两个食用菌企业的当家品种，亲缘关系非常近，有可能是从黑龙江省或吉林省引进的品种，种源不清，可能为同物异名。黑木耳遗传多样性研究是黑木耳育种的重要环节，通过对品种间亲缘关系的研究可以有效地对亲本选配和特殊种质的保护提供指导。

用同工酶标记能在一定程度上反映不同样品的遗传差异，但同工酶多态性不丰富，可检测的位点少，试验结果会因菌株培养材料、培养时间等因素的变化而变化。在今后的研究中，将引入ISSR[4]、RAPD等不同分子标记分析遗传多样性，以便为黑木耳的鉴定分类作出更加科学合理的解释提供依据[5]。

参考文献：

[1] 李 黎，范秀芝，肖 扬，等.中国木耳栽培种质生物学特性及遗传多样性分析[J].菌物学报，2010，29（5）：644-652.

[2] 杨立红，黄清荣，辛晓林，等.食用菌菌种选育中酯酶同工酶的应用研究[J].食用菌，2005，27（6）：12-14.

[3] 黄年来，林志彬，陈国良，等.中国食药用菌学（下篇）[M].上海：上海科学技术文献出版社，2010.

[4] 宋小亚，肖 扬，边银丙.ISSR标记在黑木耳单核体遗传分析中的应用[J].菌物学报，2007，26（4）：528-533.

[5] 董昌金，江 涓.RAPD和酯酶同工酶技术在香菇杂交育种中的应用[J].食用菌学报，2000，7（1）：1-7.