猴巨细胞病毒巢式PCR检测方法的建立与初步应用

王莎莎， 贺争鸣

（中国食品药品检定研究院重点实验室， 北京 100050）

猴巨细胞病毒巢式PCR检测方法的建立与初步应用

王莎莎， 贺争鸣

（中国食品药品检定研究院重点实验室， 北京 100050）

目的 建立猴巨细胞病毒（SCMV）特异的巢式PCR检测方法并研究实验猴群和猴源性生物制品中SCMV感染或污染情况。 方法 比对分析多株SCMV序列，设计SCMV特异引物，优化巢式PCR实验条件，建立的巢式PCR方法经验证后检测实验猴群和猴源性生物制品。 结果 经特异度和灵敏度鉴定，在设计的4对引物中确定一对最佳引物，可以区分SCMV和人巨细胞病毒（HCMV）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）、单纯疱疹病毒（HSV）以及犬疱疹病毒（CHV），且可以检测到的最小DNA量为18 pg/mL。PCR方法检测实验猴群和相关生物制品，发现SCMV在实验猴群中广泛存在，在相关生物制品中有感染的风险。结论 经测序验证，PCR检测方法具有很好准确性，初步应用表明我国实验猴群中SCMV高度流行，应加强实验猴群及相关生物制品中SCMV的监测，避免人类感染SCMV的潜在风险。

猴巨细胞病毒（SCMV）； 巢式 PCR； 实验猴群； 猴相关生物制品

猴巨细胞病毒（SCMV）为线性双链DNA病毒，为β亚型疱疹病毒，基因组全长为196～241 kbp，猕猴和食蟹猴SCMV的G+C含量为49%， 具有人巨细胞病毒（HCMV）的基因组结构特征， 是HCMV致病性研究的良好模型［1］，也是猴获得性免疫缺陷病毒（SIV）疫苗研究强有力的候选载体［2］。近年来SCMV还作为病毒疫苗载体构建HIV疫苗，能够给预接种疫苗动物一定程度的病毒清除［3］。PCR方法由于其安全、快速的特点在相关检测中被广泛应用。作者建立的巢式PCR方法能够实现快速批量检测猴群中SCMV的感染情况，并且灵敏度和特异性比普通PCR高。该方法还可应用于猴源性生物制品SCMV污染的检测，为保证生物制品应用的安全性提供依据，同时也为开展SCMV基因组的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1样品与毒株来源

方法的初步应用使用了猴全血样品、猴口腔棉拭子样品、猴组织样品、猴源性细胞以及相关生物材料等。共检测40份猴全血样品（猕猴、食蟹猴各20份）； 猴口腔棉拭子40份（猕猴、食蟹猴各20份）； 3组猴组织样品（猕猴2组， 食蟹猴1组）， 均采集于猴场。5株实验室常用猴源传代细胞包括猴肾细胞BSC-1， 非洲绿猴肾细胞Vero、Vero-E6， 罗猴胎肾细胞MA104， 猕猴肾细胞MK2， 均为本实验室保存。3批猴源生物材料， 为本院疫苗三室赠送。

所使用的毒株包括HCMV（本院疫苗三室赠送），单纯疱疹病毒（HSV）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）、猫疱疹病毒（FHV）、犬疱疹病毒（CHV）以及猴腺病毒（SAdV），均为本实验室保存。

1.2试剂及仪器

胎牛血清购自杭州四季青公司； PCR热启动反应体系、100 bp DNA Maker购自大连宝生物工程有限公司； PCR反应用引物均由北京擎科生物有限公司合成。 DNA快速提取试剂盒购自凯杰公司。

1.3实验方法

1.3.1靶基因的选择及引物设计巨细胞病毒属于疱疹病毒β亚型，其保守基因包含疱疹病毒核心基因以及β亚型疱疹病毒特有基因，巨细胞病毒在宿主之间又高度特异，现选取宿主为猕猴、食蟹猴的巨细胞病毒基因组的疱疹病毒核心基因UL55、UL56和β亚型疱疹病毒特有基因UL33、UL84为靶基因进行比对选取保守序列，针对该区域用Primer Premier 5.0设计引物并合成，建立巢式PCR检测方法。同时，与参照引物进行比较［4］。

4组引物（1，2，3，4）及参照引物（5）的序列见表1。

1.3.2基因组DNA提取病毒的细胞培养液经反复冻融3次后4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，收集上清。各种血液、组织、细胞以及生物制品样品DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒的说明书提取DNA， 200 μL样品提取200 μL DNA， -20 ℃保存。

1.3.3巢式PCR反应经过模板量，引物浓度，聚合酶量，循环数以及退火和延伸时间的探索，确定第一循环的体系和反应条件以及第二循环的体系和条件。

1.3.4巢式 PCR方法的特异度验证

1.3.4.1琼脂糖凝胶电泳鉴定取HCMV、MCMV、FHV、SAdV、HSV-1、HSV-2、CHV以及正常MRC-5细胞培养液。用前述SCMV病毒基因组提取方法提取DNA，以其为模板用设计的4组引物与参照引物在优化后的条件下分别进行PCR扩增，扩增产物经质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，分析所建立的巢式PCR方法的特异度，并与文献报道的方法做比较。

1.3.4.2测序鉴定利用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物与pGEM-T克隆载体连接，转化DH5α大肠杆菌，通过初步酶切鉴定，选择阳性克隆送北京擎科公司测序。

1.3.5灵敏度测定将起始浓度为180 ng/mL的DNA样本做倍比稀释，分设10-1到10-7七个浓度梯度进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断所能扩增的最小DNA模板浓度。同时，用参照引物进行相同的操作，并将所建立的PCR方法与文献报道的方法进行灵敏度比较。

1.3.6巢式PCR检测方法的初步应用将建立的巢式 PCR方法应用于猴全血样品、猴口腔棉拭子、猴组织样品、猴源性传代细胞样品、以及猴源性生物制品样品，检测个样品中SCMV的感染状况。

2　结果

2.1巢式 PCR反应及条件优化

巢式 PCR第1组引物，选取UL33作为靶基因， 外引物目的片段730 bp， 内引物目的片段439 bp。第2组引物， 选择UL84作为靶基因， 外引物目的片段463 bp， 内引物目的片段310 bp。第3组引物，选择UL55作为靶基因，外引物目的片段362 bp，内引物目的片段197 bp。第4组引物， 选择UL56作为靶基因，外引物目的片段1 206 bp，内引物目的片段768 bp。经过优化各组引物均得到最适反应体系和条件。其中，优化后引物2的内外反应体系如表2。

外引物循环反应条件为： 95 ℃预变性4 min； 95 ℃30 s， 46 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共20个循环； 72 ℃再延伸7 min。内引物循环反应条件为： 95 ℃预变性4 min； 95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共35个循环； 72 ℃再延伸7 min。

2.2巢式 PCR方法的特异度验证

5组引物在以SCMV为模板时均有明显的条带出现，阴性对照MRC-5细胞均无目的条带。引物1～4的特异度均很好，除了SCMV样品中有条带外，HCMV、MCMV、FHV、SAdV-1/SAdV-20、HSV-1/HSV-2、CHV中都未见有条带出现。参照引物的特异度较差（图2），在HCMV、FHV和CHV 的PCR反应中出现相同大小的目的条带，在其他疱疹病毒中也出现了非特异性条带。

表2　引物2优化后的反应体系

图1　引物1、引物2特异性验证

2.3巢式 PCR产物核酸序列分析

将阳性扩增片断进行克隆测序， 结果用BLAST 与NCBI中SCMV序列比对， 核苷酸符合率达99%， 证明是要扩增的SCMV目的片段， 说明该法特异性好。

2.4灵敏度鉴定

将提取核酸浓度为180 ng/mL的SCMV DNA样本用TE缓冲液做10倍稀释， 分设10-1到10-6六个稀释度进行巢式PCR扩增。引物2在10-4稀释度有较明显条带， 引物1、引物3和引物4在10-3稀释度有明显条带。对于检测样品来说，注重于微量DNA的检测，故引物2为最优检测巢式PCR引物，优化的体系和反应条件为最优方法。使用引物2对所建立的巢式PCR方法进行初步应用。

2.5检测方法的初步应用

2.5.1猴全血样品的检测取猕猴、食蟹猴全血样品各20份，进行巢式PCR方法检测，结果显示，猕猴全血样品有5份扩增后出现310 bp大小的阳性条带（图3）， 将PCR产物送北京天一辉远公司进行测序， 取5号样品结果与NCBI进行比对， 与180.92株的同源性为98%，与Ottawa株的同源性为97%。食蟹猴全血样品中未检测出SCMV阳性（图4）。

礼者，以财物为用，以贵贱为文，以多少为异，以隆杀为要。文理繁，情用省，是礼之隆也；文理省，情用繁，是礼之杀也；文理、情用相为内外表里，并行而襍，是礼之中流也。故君子上致其隆，下尽其杀，而中处其中。

2.5.2猴口腔棉拭子的检测猕猴、食蟹猴口腔棉拭子各20份提取DNA，进行巢式PCR检测，结果发现20只猕猴的口腔棉拭子全呈阳性结果， 18只食蟹猴口腔棉拭子阳性，2份阴性。

2.5.3猴组织样品的检测取2只猕猴（M1、M2），1只食蟹猴（S1）肝、脾、肺、肾、小肠组织各100 mg，研磨后提取组织细胞DNA，并对其进行SCMV 巢式 PCR检测（图5）。

2.5.4猴源性传代细胞的检测BSC-1、MA104、Vero-E6、MEK、Vero细胞均未检出SCMV病毒核酸序列（图6）。说明目前实验室使用的猴源传代细胞未受SCMV污染。

2.5.5猴源性生物制品的检测对连续生产的3批猴源性生物制品进行检测，显示有SCMV核酸序列的存在（图7）。将阳性样品PCR产物进行克隆测序，测序结果与NCBI上公布的SCMV UL84基因进行同源性比对，同源性为98%。

3　讨论

SCMV在猴群中多为隐性感染，国外报道SCMV在野外猴群的血清抗体阳性率达到90%以上，笼养的猴血清抗体阳性率则达到50%［5］。国内对猴群中SCMV感染流行情况研究很少，猴源性生物制品中SCMV污染情况尚未见报道。有学者针对SCMV的疱疹病毒核心基因设计巢式引物，证明国内笼养猴群中存在SCMV感染［4］。经特异度验证该方法特异度较差，不能区分SCMV与HCMV、FHV以及CHV。

图3　猕猴全血样品巢式 PCR结果

图4　食蟹猴全血样品巢式PCR结果

图5　猴组织样品巢式 PCR结果

图6　传代细胞DNA样品巢式PCR结果

图7　猴源性生物制品样品巢式PCR结果

3.1方法建立

本实验通过对引物浓度、Taq酶用量、退火温度、模板量进行优化并经特异性和敏感性验证，成功筛选出一对特异性好、灵敏度更高的引物，目的条带大小为310 bp。特异性敏感性结果表明，本方法可以区分SCMV与HCMV、MCMV、HSV以及CHV，而且能够在猕猴和食蟹猴群中检出SCMV。敏感性验证显示其能检测到的最小DNA模板浓度为18 pg/mL。

3.2猴全血、口腔棉拭子中SCMV的检测

本实验将猴全血样品，口腔棉拭子进行比较，发现全血样品中SCMV检测阳性率较口腔棉拭子的阳性率低，说明口腔棉拭子可以作为较可靠的SCMV检测样品形式，这与Huff等［6］对猴的各种体液样品进行的病毒SCMV核酸检测，显示口腔棉拭子的阳性率最高的结果一致。说明SCMV在感染个体中体液的分布有一定的偏好性。

SCMV的初次感染主要通过口腔黏膜接触感染病毒的乳汁或唾液， 通过血液向全身扩散。感染早期， 即可在血浆中检测出病毒DNA阳性。动物实验性注射或者灌服猕猴巨细胞病毒7 d后血浆中检测到病毒DNA达到峰值， 然后会慢慢减少， 但下降速度随个体不同有差异［7］， 有的在注射病毒3周后血浆SCMV 核酸转阴， 有的血浆中的病毒核酸则能一直持续到11周之后。初次感染猴血浆中的病毒清除后，血浆会保持长时间的SCMV核酸阴性状态。接受病毒后2周， 猴组织各器官中可陆续检测到SCMV， 通常被检测到的组织包括脾、淋巴管、肾、骨髓、肝、腮腺、颌下腺［7，8］。

3.3猴组织样品中SCMV的检测

免疫功能健全猴个体中SCMV的自然感染病变主要见于唾液腺、淋巴结和肾［7］。在猴免疫缺陷病毒感染的个体中，常见SCMV机会感染，SCMV活化感染与脑膜炎、肺炎、淋巴结炎、脾炎、睾丸炎和神经炎的发展有关，与大动脉以及消化道病变有关［9，10］。本文作者在组织细胞的检测中，2只猴组织的脾和肾均发现SCMV DNA阳性，而肝、肺和小肠则未发现阳性，与上述论断一致。猕猴M1的肝、脾、肺、肾出现SCMV阳性，而小肠未出现SCMV阴性，可能该猕猴免疫功能较低，使SCMV在体内组织细胞出现大范围感染。

3.4猴源性生物制品中SCMV的检测

由于猴群中常存在SCMV隐性感染， 易导致用于口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）生产用的原代猴肾细胞污染［11］。本实验中实验室猴源传代细胞未发现SCMV污染，但猴源性生物制品的SCMV检测显示阳性，说明生产用猴肾细胞的SCMV污染严重。猴源性生物制品每批样品中的阴、阳性不一致， 造成该结果的原因可能是多方面的， 如样本本身的质不均一性、污染来源以及核酸提取时质不均一性等。如需确定猴源性生物制品中SCMV的污染情况，还需进一步扩大检测样本数量。虽然SCMV有严格的物种特异性， 自然情况下不存在交叉感染，但是不能排除人通过生物制品接触病毒后无害。而2013年录入NCBI Genbank的毒株strain Colburn记载其来源于患临床脑病的男孩， 说明生物制品中SCMV的污染对人类健康存在潜在的威胁。

作者建立的SCMV核酸巢式 PCR检测方法具有快速、简便、准确等优点，可实际应用于监测猴群SCMV感染，也适用于猴源性生物制品SCMV污染的检测，对于建立高质量的实验猴群和保证猴源性生物制品安全具有重大意义。

［1］Hansen SG， Strelow LI， Franchi DC， et al. Complete sequence and genomic analysis of rhesus cytomegalovirus［J］. J Virol，2003， 77（12）：6620-6636.

［2］Hansen SG， Piatak JrM， Ventura AB， et al. Immune clearance of highly pathogenic SIV infection［J］. Nature， 2013， 502 （7469）：100-104.

［3］Barouch DH， Picker LJ. Novel vaccine vectors for HIV-1［J］. Nat Rev Microbiol， 2014， 12（11）：765-771.

［4］黄璋琼， 叶尤松， 江勤芳， 等. 猕猴巨细胞病毒（RhCMV）nested PCR检测方法的建立与初步应用［J］. 四川动物，2007， 26（4）：78-81.

［5］Alcendor DJ， Zong J， Dolan A， et al. Patterns of divergence in the vCXCL and vGPCR gene clusters in primate cytomegalovirus genomes［J］. Virol， 2009， 395（1）：21-32.

［6］Huff JL， Eberle R. Differential detection of B virus and rhesus cytomegalovirus in rhesus macaques［J］. J Gene Virol， 2003，84（1）：83-92.

［7］Lockridge KM， Sequar G. Pathogenesis of experimental rhesus cytomegalovirus infection［J］. Virol， 1999， 73（11）：9576-9583.

［8］Sequar G， Britt WJ， Lakeman FD， et al. Experimental coinfection of rhesus macaques with rhesus cytomegalovirus and simian immunodeficiency virus： pathogenesis［J］. J Virol， 2002， 76（15）：7661-7671.

［9］Hutto EH， Anderson DC， Mansfield KG. Cytomegalovirusassociated discrete gastrointestinal masses in macaques infected with the simian immunodeficiency virus［J］. Vet Pathol， 2004 ，41（6）：691-695.

［10］ Macri SC， Knight HL， Miller AD. Mesenchymoproliferative enteropathy associated with dual simian polyomavirus and rhesus cytomegalovirus infection in a simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaque （Macaca mulatta）［J］. Vet Pathol， 2013， 50（4）：715-721.

［11］ Sierra-Honigmann AM， Krause PR. Live oral poliovirus vaccines and simian cytomegalovirus［J］. Biologicals， 2002， 30 （3）：167-174.

Establishment of Nested PCR Detection Method for Simian Cytomegalovirus and Preliminary Application

WANG Sha-sha， HE Zheng-ming
（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

Objective To establish simian cytomegalovirus （SCMV） specific nested PCR detection method， and to investigate SCMV infectious status in monkeys and related biological products. Methods Designed primers based on SCMV sequences and different monkey species and biological products were used to optimize the experiment. Results The established nested PCR detection method for SCMV can distinct SCMV from HCMV， MCMV， HSV and CHV， the test sensitivity is to viral DNA 18 pg/mL. By this nested PCR method， SCMV positive results were detected in monkeys and biological products， which suggested the high infection rate existed in monkeys and its biological products. Conclusions Nested PCR detection method has a good accuracy and sensitivity. It is found that high prevalence in Chinese primate colony. It is necessary to enhance detection for SCMV in monkeys and relevant biological products and to avoid potential risk of infecting in human.

Simian cytomegalovirus （SCMV）； Nested PCR； Detection and application

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0467-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.008

2015-04-30

国家科技支撑计划， 实验动物质量检测关键技术研究（2013BAK11B01）

王莎莎（1989-）， 女， 硕士， 研究方向： 实验动物病毒学。E-mail： wangsha0316@126.com

贺争鸣（1957-）， 男， 博士， 研究员， 研究方向： 微生物学。E-mail： hezm@nicpbp.org.cn