苏姜猪Lrh—I基因PCR—SSCP多态性及其与产仔数的关系

王利红　袁旭红　魏萍萍　张瑞　王维　李丹　林伟

摘要：为深入研究苏姜猪肝受体类似物质-1（Lrh-I）基因的多态性及其与产仔数性状间相关性，依据NCBI数据库中猪Lrh—I基因核酸序列设计2对引物，采用聚合酶链式反应一单链构象多态性（PCR-SSCP）方法对苏姜猪Lrh-I基因进行多态性检测。检测结果显示，引物P1 PCR扩增产物存在7种SSCP条带型，共有4个碱基突变位点，分别为27287662、27287593、27287535和27287511位；引物P2 PCR扩增产物存在2种SSCP条带型，碱基突变位于27423038位；将扩增序列与猪Lrh-1CDS区进行比对分析，其中27287662、27287593和27423038位的碱基突变位于配体结合域（LBD）区内，且突变均属同义突变，表明LBD区对于Lrh-I基因功能稳定具有重要作用；不同碱基突变位点的基因频率经群体遗传学分析，除27287511位点处于群体不平衡状态（P<0.05）外，其他位点均达群体平衡状态（P>0.05）；Lrh-I基因}）1和P2扩增区SSCP不同类型苏姜猪第1胎和第2胎平均产仔数间无显著差异（P>0.05）。

关键词：苏姜猪；肝受体类似物质-1（Lrh-I）；聚合酶链式反应一单链构象多态性（PCR-SSCP）；产仔数

中图分类号：Q953 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0021-04

肝受体类似物质一1（1iver receptor homolog-1，Lrh-I）是核受体7个亚家族成员（NRO～NR6）中的第5个，该亚家族包含4个不同成员，Lrh-I是其中第2个，故也称其为NR5A2（nuclear receptor subfamily 5，group A，menlber 2）。Lrh-I是动物机体中一种重要的核受体，Lrh-I基因首次发现于小鼠肝组织，现已在人、大鼠、马、鸡、羊、鱼、蛙、牛、猪等生物体内均检测到，并已确认在动物早期胚胎发育、分化以及物质代谢活动，如胆固醇代谢、胆汁酸动态平衡、激素生成等过程中，Lrh-I基因具有重要作用。

苏姜猪是以姜曲海猪、枫泾猪、杜洛克猪为亲本，经过6个世代继代选育培育而成的新品种。该品种具有血统来源丰富、繁殖性能良好、肉质性状优良、适应性强等特点。本研究采用PCR—SSCP方法首次进行苏姜猪Lrh-I基因核酸序列检测分析，以期获得苏姜猪Lrh-I基因多态性及群体遗传分布特点，并与产仔数性状间进行关联分析，为深入研究Lrh-I基因的结构特点及其与动物繁殖性状间的关系提供理论依据。

1.材料与方法

1.1试验材料

随机选取50头经产苏姜种母猪，用酚-氯仿抽提法提取耳组织DNA，超纯水稀释至100ng/ul，-20℃保存备用。

1.2Lrh-I引物设计

根据GenBank数据库中猪Lrh-I基因序列JQ_527656.1、NM_001267893.1、NC_010452.3为依据，采用Primer premiers5.0软件设计2对引物（表1）。

1.3PCR—SSCP检测

依据表1中不同引物退火温度，进行样本Lrh-I基因PCR扩增。取5uL PCR产物和10uL变性剂[98%甲酰胺、0.025%二甲苯青、10%甘油、10 mmol/L EDTA（pH值8.O）、0.025%溴酚蓝]，98℃变性10min，迅速冰浴10min。变性后产物在8%非变性聚丙烯酰胺：甲又双丙烯酰胺（29：1）凝胶中电泳，之后银染显带，拍照分析。

1.4PCR产物测序

经SSCP电泳后，将不同条带型PCR产物送至上海基康生物技术有限公司测序。

1.5统计分析

试验数据用SPSS13.0统计软件进行差异显著性检验分析。依据哈迪一温伯格定律检测相关基因频率群体平衡性。

2.结果与分析

2.1Lrh-I基因2对引物PCR扩增结果

Lrh-I基因2对引物P1和P2 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳（图1），结果显示条带清晰，表明该2对引物的PCR扩增特异性好。将PCR扩增产物测序后，进行NCBI数据库BLAST分析，结果显示扩增产物与猪，Lrh-I基因序列有高度相似性，引物Pl和P2 PCR扩增产物与JQ_773337.1、JQ_627655.1和NM_001267893.1序列覆盖区相似度分别为99%和98%，表明本试验所扩增的核酸序列在，Lrh-I基因区。

2.2SSCP分析

对Lrh-I基因2对引物PCR产物进行SSCP分析，结果显示均存在多态性。引物P1、P2 PCR扩增产物分别存在7、2种SSCP条带类型（图2、图3）。

2.3SSCP不同类型核酸序列分析

2.3.1引物P1 PCR-SSCP不同条带类型核酸序列分析将SSCP不同条带类型的引物Pl PCR扩增产物序列与NC_010452.3进行比对分析，结果显示，不同SSCP条带类型核酸序列主要在NC-010452.3序列相应的27287662、27287593、27287535和27287511这4个位点存在碱基差异。通过将引物P1 PCR扩增产物与NM_001267893.1序列进行BLAST分析，可知27287662与27287593位点处于CDS区。27287662和27287593位点碱基突变分别为A-G和c-T，且均为同义突变；27287535和2728511位点则均为A-G的突变（表2）。

2.3.2引物P2 PCR—SSCP不同基因型核酸序列分析将引物P2 PCR扩增的不同基因型产物序列与NC_010452.3进行比对分析，结果显示，在NC-010452.3序列对应的27423038位存在A-C的同义突变（表3）。

2.3.3苏姜猪，Lrh-I基因群体遗传分析苏姜猪，Lrh-I基因引物P1和P2扩增区不同SSCP型频率以及基因频率见表4至表6，结果显示，引物P1扩增区SSCP-1和SSCP-5型所占比率较高，在4个碱基突变位点中仅27287662位点存在3种基因型，另3个位点均缺少1种纯合基因型。根据哈迪一温伯格定律，对苏姜猪，Lrh-I基因引物P1和P2扩增区进行基因群体平衡性x检验，结果表明，引物P1扩增区27287662、27287593、27287535位点基因分布符合哈迪一温伯格定律，处于群体平衡状态（P>0.05），27287511位点基因分布不符合哈迪一温伯格定律，处于群体不平衡状态（P<0.05）；引物P2扩增区基因分布符合哈迪一温伯格定律，处于群体平衡状态（P>0.05）（表7）。

2.3.4Lrh-I基因不同SSCP型与产仔数间相关性分析根据生产记录对苏姜猪进行Lrh-I基因不同SSCP型产仔数统计分析（表8），结果表明，苏姜猪，Lrh-I基因P1和P2扩增区不同SSCP型第1胎和第2胎平均产仔数均无显著差异（P>0.05）。

3.结论与讨论

Lrh-I基因属核受体亚家族，主要表达于动物的肝脏、性腺、胰腺等组织。Lrh-I具有调节胆汁酸的平衡、类固醇合成、胆固醇逆转运以及早期胚胎发育等功能。最近有研究认为磷脂质是Lrh-I潜在的配体。与其他配体激活转录因子的核受体家族成员一样，Lrh-I具有保守的DNA结合域DBD（nuclear receptor-DNA binding domain-like）、可变的N末端、绞链区和一个C端配体结合域LBD（nuclear receptor-lingand binding domain_Lrh-1）。

猪Lrh-I基因位于10号染色体，其编码区CDS（codingsequences）共有1332个碱基，可翻译成含443个氨基酸的蛋白质，2个保守结合域DBD、LBD分别位于第40～80、203～443氨基酸区，DBD区含2个C4型锌指结构，LBD区含有3个特殊识别位：第235～240、242～244、321、422～424、426～428、430～431位氨基酸为同型二聚体界面位，也为多肽结合位；第244、247～248、284～285、288、292、307、318、321～323、326、329～330、415、418～419、422位氨基酸为配体结合位，也为化学结合位；第256、259、263、273、276～277、280～281、432～433、436～437位氨基酸为辅阻遏物识别位。

本研究通过PCR—SSCP方法，首次对苏姜猪，Lrh-I基因序列LBD区部分序列进行了多态性检测。引物P1 PCR扩增区共检测到7种SSCP条带型，其中相对较高的条带型为SSCP一1型（24%）和SSCP一5型（26%），表明在苏姜猪群体中该区段的碱基差异较大，这可能与其源于多个猪品种的培育史有关。对不同SSCP型样本核酸序列检测分析，结果显示共存在4处碱基突变位点，分别对应于NC_010452.3序列的27287662、27287593、27287535和27287511位点，其中前2个位点处于猪Lrh-I基因CDS区。经分析，在27287662位点存在A—G的碱基突变，位于密码子的最后1位，即由原UUU密码子变为UUC，相对应的氨基酸均为苯丙氨酸，处于猪Lrh-I蛋白质氨基酸组成的第345位，未在特殊功能结合位；在27287593位点为c—T的碱基突变，也发生在密码子的最后1位，即由原GCG密码子变为GCA，相对应的氨基酸均为丙氨酸，处于猪Lrh-1蛋白质氨基酸组成的第322位，位于配体结合位。然而，这2处碱基突变均为同义突变，对Lrh-I结构及功能不会造成影响。引物P2PCR扩增区共检测到2种SSCP条带类型（AA型和AB型），其中AA型（84%）所占比例远高于AB型（16%）。通过检测2种类型样本的核酸序列得知，在对应的NC_010452.3序列27423038位存在A-c的碱基突变，该碱基位于密码子第3位，使原密码子CGG变为CGU，相对应的氨基酸均为精氨酸，属同义突变，未对Lrh-I基因结构及功能造成影响，进一步体现Lrh-I基因LBD区域的保守性和功能重要性Lrh-I。对于LBD区其他未扩增区段以及DBD区核酸序列是否也存在碱基突变情况，将在日后的研究中进一步检测分析。

苏姜猪群体中引物P1扩增区4个突变位点仅27287662位点存在3种基因型（CC、CD、DD），其他3个突变位点均缺少1种纯合型，引物P2扩增区也缺少1种纯合型。经基因群体遗传平衡分析，除引物P1扩增区27287511位点未达群体平衡（P<0.05）外，其他4个碱基突变位点均达群体平衡（P>0.05），此现象可能与苏姜猪有针对性的选择培育有关，但在群体中未检测到部分位点的纯合型个体则可能与其他基因或性状存在关联影响，有待深入研究。

Lrh-I基因在动物卵巢卵泡颗粒细胞和妊娠黄体细胞中通过调控SR-BI，和CYPl9基因的表达，进而调控雌激素的生物合成；敲除小鼠Lrh-I基因，可影响卵巢卵泡排卯功能。这些现象均表明Lrh-I因与动物繁殖机能有重要相关性。本研究将Lrh-I基因引物Pl和P2扩增区不同SSCP类型与苏姜猪产仔数进行关联分析，结果表明，不同SSCP类型与第1、2胎产仔数间均无显著影响（P>O.05）。但从引物P1扩增区4个碱基突变位点的杂合情况看，苏姜猪第1胎SSCP一7型平均产仔数相对最低，为8.20±2.49头，其4个碱基突变位点均为纯合型，而其他SSCP型至少有1个碱基突变位点为杂合型，表明引物P1扩增区相应碱基突变位点的杂合可能有助于产仔数性状的提升。引物P2扩增区2种基因型在第1、2胎产仔数性状上也未达到显著差异水平（P>0.05），但相对而言，苏姜猪AA型平均产仔数高于AB型，表明27423038位点碱基的突变可能不利于产仔数性状的提升.