端粒酶荧光标记法在癌症方面的应用研究

【摘要】近几年，端粒酶的相关研究非常活跃，随着研究的深入，人们对其结构、性质、功能和性质有了更深的了解，因此对细胞的癌变有了新的认识，即端粒酶的检测技术对恶心肿瘤的早期诊断及后期监测提供了数据支持，本文通过端粒酶的荧光检测法对癌细胞的检测方法进行了研究。

【关键词】端粒酶；癌细胞；肿瘤诊断

1、实验

1.1培养HeLa细胞

1.1.1培养基的制作：RPMI1640培养基，在加入1%至2%的琼脂做冷凝剂后，补充培养100U/mL的链霉素、青霉素和10%的胎牛血清。

1.1.2细胞的培养：先将这些细胞放在含95%空气，5%二氧化碳的37摄氏度的气氛中培养，在细胞的繁殖期，再加入胰蛋白酶之前需要先将泛黄的培养基倒尽，再放入培养箱中大约五分钟，待其消化完毕，倒出，再加入新的培养基，吹洗两分钟后，当观察到细胞从壁上脱落，并且细胞团被吹散停止，然后用血球计数板计数。

1.2端粒酶的提取及预处理

1.2.1提取端粒酶：第一步，将计数收集到的1.0×106个细胞置于1.5mL的离心管中，在2000转4摄氏度的条件下离心3分钟达到去除培养基的作用，再用0.3M的氯化钠溶液在弱碱性条件下洗涤三次，弃去上清液后，加入0.1mL的裂解液，然后冰浴裂解0.5h（移液枪抽取三次），再在4摄氏度1200转速下离心20分钟，取出上清液于离心管中，迅速置于液氮中冷却，备用。

1.2.2固定DNA探针：在处理好的金电极表面滴加疏基修饰的寡核咁酸探针的TE-氯化钠缓冲液，在4摄氏度下组装，然后将组装完毕的电极放在弱碱性的氯化钠溶液中清洗10分钟，达到除去吸附探针的效果。

1.3荧光性的电化学分析

1.3.1电化学响应：传感器对端粒酶影响的电化学特征变化为：在端粒酶存在的条件下，T链的S沿着3号末端开始扩散增重得到S3长链，新增的重复段的序列与杂交区域的碱基是互补的，不能构成稳定的双链，用二价铁标记的DNA链的S2会产生很小的电流峰，随后加入HeLa灭活细胞的提取物，将被热破坏的RNA模板用引物链来扩增S1，此时，两个链会发生碱基的互补配对，由二茂铁标记的S2在靠近电机的表面时发生电子传递，由还原峰电流可以看出电子传递效应十分高效。同理，我们又引入了探针S4和S5，在端粒酶存在的条件下，得到了TTGAAA碱基长链，但与S1不同的是，他仍有8个互补的碱基对，并且通过电分析信号，发现在0.23V处产生了明显的信号。接下来，我们设计了一组对比试验（空白试验），在其与条件相同的情况下，加入了端粒酶的失活物，结果在传感器谱图立刻出现了一个峰，与标准谱图比较后发现，这是一个典型的二茂铁还原峰。综上，我们可以得出这样一个结论，在端粒酶存在的情况下，由二茂铁标记的S2 DNA链上的Fc从电极表面释放下来。

1.3.2荧光活性的检测：将HeLa细胞裂解后，提取10微升的DNA修饰液，调节pH至8.2，再计入1.5微升饱和氯化镁和氯化钾溶液，32摄氏度恒温箱中放置2h，然后使用荧光分光光度计进行荧光强度的检测。

1.3.3延伸性的电化学检测：将60微升的裂解后的端粒酶扩增液等分成十份，每份加入10微升的EDTA，同样置于32摄氏度的恒温箱2h，需要注意的是裂解液是NB-47裂解液在90摄氏度水中灭火0.5h后加入等体积盐酸后的溶液。将电极插入由3毫升NB-47和12毫升DPR混合液中，再进行电化学检测。

1.3.4端粒酶的胶体性电泳检测：先称取1g琼脂，在电炉上配成琼脂的饱和液，再加入1.3.3中得到的液体和20mLTBE电泳缓和液，加热至溶胶整体呈透明状，冷却后倒入电泳槽中，需控制溶胶层的厚度在0.30cm至0.52cm，再加入少量缓冲液，准备点样（用荧光标记的探针和非疏基标记探针分别在S6和S7的1：1混合液中退火杂交，然后让杂交后的的产物在ETA中扩增）。3微升的酚溴蓝和8微升的端粒酶提取液，混合十分钟后，倒入电解槽中，通电，电压控制在100V，时间1.5h，利用电泳凝胶成像仪成像检测。

1.4癌细胞分析

1.4.1检测标准选择：MRNAturalist与端粒酶的活性无关，但是在mRNA发生htert表达后则会相关，所以htert后的mRNA可用于对肿瘤细胞的检测标定，与肿瘤病理分期Ki-67的表达相关。并且有研究证实，尽管htert的表达水平与预后没有关系，但是它的完整长度htert的剪形与肿瘤的病理分期还是一样的，可作为检测标准。

1.4.2技术问题分析：不是所有的肿瘤标本都能够检测到端粒酶，这和肿瘤细胞的病理分期、细胞的分化程度和组织学分型有关，有些阶段和类型的肿瘤细胞内并没有端粒酶或者里面的端粒酶根本不表达，这对恶心肿瘤的早期诊断、治疗、监测和预后判断造成一定的影响，可能存在的原因有以下几点：（1）端粒酶的活性太低，低于检测线，导致检测不到；（2）检测端粒酶主要监测的是端粒酶的表达效果，有些端粒酶是不表达的；（3）所监测的样本中存在检测抑制物或干扰物，影响检测；（4）肿瘤细胞的生长周期处于静止期，导致端粒酶的活性降低；（5）肿瘤细胞彼此之间发生了重组，导致基因组重组，加长了端粒酶的长度。

2、结论

端粒酶检测技术已经可以在肿瘤诊断中起作用，但是由于端粒酶活性过低、癌细胞生长周期以及发生重组等原因，仍会对检测造成影响，但是端粒酶的活性是细胞增殖的生物学的一个重要的指标，特别是在未来生物学以及医学方面的应用。因此，在端粒酶诊断恶心肿瘤时要慎重对待，考虑以上提及的各种情况，以免发生误导。

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作者简介

戴鑫禹（1994-），女，汉族，辽宁省海城市人，本科，单位：沈阳师范大学，研究方向：生物科学.