秋水仙素在肺癌染色体鉴定方法中的应用研究

彭积贵　何昌进

[摘要] 目的 探索一种肺癌染色体分析的有效方法。 方法 通过原代培养获取肺癌单细胞，采用G显带染色，比较不同秋水仙素作用量和作用时间及不同低渗时间所获取的染色体数量、形态及条带情况。 结果 秋水仙素0.1 μg/ml作用100 min，低渗20 min获得的染色体数量多、形态规则匀称，条带清晰。 结论 秋水仙素可用于肺癌核型分析及获取肺癌染色体谱。

[关键词] 秋水仙素；肺癌；染色体；核型分析；优化

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate a effective method on the Colchicine in chromosome identification method in lung cancer. Methods Single cell was obtained from primary culture，the number，morphology and strip situation of lung chromosome with the different dosage and time of colchicine as well as different hypotonic time via uesing G—banding were compared. Results The chromosome with better quantity，regular morphology and clear bands was obtained in the group treated with 0.1 μg/ml Colchicine culturing 100 min and hypotonicing 20 min. Conclusion Colchicine can be used for karyotype analyses，and the chromosome in lung cancer is obtained.

[Key words] Colchicine；Lung；Chromosome；Karyotype analyses；Optimization

肺癌是全球高发恶性实体瘤之一，其发病率与死亡率均占恶性肿瘤首位。肺癌等实体瘤中广泛存在染色体异常，染色体异常导致基因异常扩增、表达与肿瘤发生、发展、预后等密切相关[1-3]。实体瘤的染色体不稳定性研究可为肿瘤治疗提供新的治疗靶点，如淋巴瘤、慢性粒细胞白血病等血液病中特异染色体异常，为该病治疗提供有效方法[4]，然而，实体瘤与血液肿瘤存在组织差异，导致其染色体分析更为复杂、困难。本文通过优化实体瘤染色体分析相关影响因素对肺癌核型分析方法进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）、氢化可的松、青链霉素、0.25%胰蛋白酶，均购自美国Gibco公司；胶原酶购自美国Sigma公司；分散酶购自瑞士Roche公司，秋水仙素、Giemsa染料购自北京天恩泽基因科技有限公司。其他试剂均为分析纯以上。

1.1.2 组织标本 肺癌标本取自2013年5月～2014年5月福建医科大学附属宁德市医院新鲜手术标本，术前未进行放疗和化疗，术后均经常规病理证实，并经医院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.1 原代培养

取新鲜肺癌手术组织，将组织块剪碎，加入25 ml消化酶（0.1%Ⅱ型胶原酶、0.15%分散酶），37℃消化至组织块消失，过滤离心2遍，加入培养基，37℃培养72 h后进行制片。

1.2 染色体制备

1.2.1 秋水仙素用量 取原代肺癌细胞A、B、C、D、E五组，每组分5份，实验前夜换液，次日分别加入浓度为20 μg/ml的秋水仙素30、40、50、60、70 μl，37℃培养120 min，离心去上清液，分别加入0.075 mol/L氯化钾溶液，低渗30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比较秋水仙素不同浓度的作用效果。

1.2.2 秋水仙素作用时间 根据1.2.1所得最佳结果取原代肺癌细胞A、B、C、D、E五组，每组分5份加入秋素，37℃分别培养80、100、120、140、160 min，离心去上清液，分别加入0.075 mol/L氯化钾溶液，低渗30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比较秋水仙素不同培养时间的作用效果。

1.2.3 低渗时间 根据1.2.1和1.2.2所得最佳结果取原代肺癌细胞A、B、C、D、E五组，每组分5份加入秋水仙素培养，离心去上清液，分别加入0.075 mol/L氯化钾溶液，分别低渗10、20、30、40、50 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比较不同低渗时间的作用效果。

1.2.4 固定 低渗后加入现配固定液（醇∶冰醋酸=3∶1）2 ml混匀，预固定5 min，1000 r/min离心10 min，去上清液，加固定液8 ml，重悬混匀后固定10 min，重复2遍，去上清液。

1.2.5 滴片、烤片 每管加入新鲜固定液0.5～1 ml混匀成细胞悬液，取1滴细胞悬液滴至预冷的-20℃载玻片中使细胞均匀散开，放置80℃烤箱烤片5～6 h。

1.2.6 染色 将烤好的载玻片放入37℃胰酶消化27 s，每张加入Giemsa染料2 ml，染色6 min，自来水冲洗去除染料，置滤纸上，室温干燥。

1.2.7 镜检 每张片高倍镜下随机选取10个视野，观察并记录分裂中期细胞数，油镜下观察染色体形态特征。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，组间采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 秋水仙素用量

原代肺癌细胞中加入不同浓度秋水仙素，在作用时间和低渗时间不变的情况下，秋水仙素浓度越高，染色体长度越粗短（图1），但获得的分裂中期细胞数差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

2.2 秋水仙素作用时间

秋水仙素作用时间越长，染色体长度越粗短（图3），且获得的分裂中期细胞数相对增多，但差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。

2.3 低渗时间

低渗时间短，获得的分裂中期细胞数多，染色体易叠加成团，低渗时间长，获得的细胞数少，染色体易分散，40 min和50 min组与10、20、30 min组比较差异有统计学意义（P<0.05）（图5）；原代肺癌细胞中加入秋水仙素50 μl培养100 min，低渗20 min，获得的染色分散均匀，长度适中，形态规则，条带清晰，有利于染色体观察分析（图6）。

3 讨论

细胞核型鉴定临床上多见于血液肿瘤及先天性遗传病，明确细胞核型对指导血液肿瘤的治疗及评估预后具有重要的指导意义。Grigorova等[5]通过细胞系培养核型分析发现肺癌等实体瘤中也存在大量的染色体变异，且不同的核型变化对临床肺癌治疗具有一定的指导意义。此外，多项研究表明，肺癌染色体形态多形性对预后具有指导性意义[6-7]。然而，由于实体瘤组织呈团块状，癌灶中细胞周期存在明显差异，且需将组织块消化成单细胞，这些特性将影响秋水仙素的作用量和时间及细胞低渗时间等，因此实体瘤核型鉴定需对秋水仙素等影响因素进行优化。秋水仙素具有抑制细胞分裂前期纺锤丝的形成，使细胞分裂停留在中期，以积累大量的中期细胞的功能[8-10]。然而秋水仙素对细胞具有一定毒性，分裂中期染色体形态随秋水仙素的量及作用时间变化而发生改变，严格掌握秋水仙素作用时间和量是染色体制片成功的关键[11-13]。秋水仙素的浓度和培养时间只有精确到最小浓度和最佳时间，才能收集到中期棒状的染色体，浓度过大产生细胞毒性作用，染色体快速凝缩，使分裂相减少和染色体臂短粗，表面毛糙，边缘不齐，明暗带纹显示不清，影响G显带制作效果，若阻断培养时间超时，中期染色体在秋水仙素的作用下逐渐凝缩，染色体丢失，制片失败[14-15]。本文采用细胞原代培养法获取原代肺癌细胞，通过比较不同秋水仙素浓度及作用时间发现，0.1 μg/ml（50 μl）秋水仙素作用100 min，染色体大小长短适中，形态规则，适合G显带及观察。低渗时间是另一个染色体制片的重要影响因素，低渗时间长，细胞膜易破裂获得细胞数少，且原代肺癌细胞经消化后细胞膜损伤更易发生破裂，若低渗时间短，细胞膨胀不充分，滴片后包浆不易分散，背影杂质多，且染色体易叠加成团，影响核型分析。有研究证实，通过不同时间的低渗实验发现低渗时间20～30 min染色体分散良好，包浆去除完全[16-18]。本文通过比较10～50 min 5组低渗时间所获得的中期细胞数，结果发现，低渗40 min后细胞膜破裂数明显增多，高倍镜下中期细胞数减少，低渗20 min染色体分散均匀，染色体间距适中，不易发生染色体丢失。

细胞核型制片过程中存在许多影响因素，除上述秋水仙素和细胞低渗外，空气干湿度对烤片时间长短也有影响，空气湿度大则烤片时间需加长，烤片后胰酶消化需严格秒表控制时间，否则将影响最后染色效果。制片过程中操作应轻柔，特别低渗重悬时，若力量过大细胞易破裂导致染色体丢失。因此，染色体制片是一个要求严格而精确的过程，掌握每个操作环节要求和规范对获得完整细胞核型进行分析至关重要。

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（收稿日期：2015-04-09 本文编辑：王红双）