基于λ核酸外切酶辅助放大的化学发光传感器用于DNA的灵敏检测

陈佳等

摘 要 基于G-四链体/血红素 DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的辅助放大功能，以17个碱基的DNA片段作为模型分析物，构建了一种快速、灵敏、特异性好的新型Luminol-H2O2-G-四链体/血红素 DNA酶化学发光传感体系。考察了λexo用量、Luminol浓度、H2O2浓度、溶液pH值对体系化学发光强度的影响。在最佳实验条件下，即：pH=9.0，10 units λexo， 1.0×103 mol/L Luminol，3.0 × 102 mol/L H2O2，测得DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L的浓度范围内与Luminol的相对化学发光强度之间呈现良好的线性关系，检出限（3σ）为0.7×1013 mol/L。本方法可以区分不同错配的核酸序列，并可用于复杂生物样品的分析。

关键词 λ核酸外切酶；G-四链体/血红素DNA酶；化学发光；DNA

1 引 言

DNA是生物体遗传信息的载体[1]，构建快速、灵敏、高选择性的生物分析新方法用于低丰度的DNA序列的检测在临床诊断、基因筛选、食品和环境监测、国土安全等方面起着至关重要的作用[2，3]。近年来，信号放大已经成为提高DNA检测灵敏度的重要手段，如采用纳米材料作为信号放大的标记物、采用聚合酶链反应（PCR）或者滚环扩增（RCA）等核酸扩增技术等。虽然这些方法大大提高了检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐、费时、价格昂贵、易出现假阳性信号等缺陷[4，5]。使用限制性内切酶进行信号放大的方法，较以往的信号放大方法更为简单、快速，但是由于限制性内切酶只能针对特定的DNA序列，在实际应用中存在一定的局限性[6，7]。因此，发展快速、灵敏的DNA测定新方法具有重要的理论和实际意义[8]。

λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）是一种高持续性核酸外切酶，能够催化双链DNA分子自5′磷酸末端→3′方向逐步水解，并释放出5′-单核苷酸，进而将双链DNA变成单链DNA[9，10]。λexo在核酸重组、复制、分型、基因修复以及分子克隆等方面起着至关重要的作用，已成为研究基因组成、功能及表达的重要工具之一。此外，许多研究者将λexo的独特性质应用于核酸探针的信号放大技术，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测[11～14]。但是这些方法大多需要对核酸探针进行荧光标记，过程复杂且成本较高。

G-四链体/血红素 DNA酶（G-Quadruplexes/hemin DNAzyme）是一种具有催化性能的人工模拟酶，由富含鸟嘌呤碱基的核酸分子与血红素结合，形成稳定的G-四链体结构，表现出类似于辣根过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）产生颜色变化或者催化H2O2氧化鲁米诺（Luminol）产生化学发光[15～17]，在生化分析领域已经引起研究者的广泛关注[18]。

化学发光（Chemiluminescence， CL）分析由于不需要激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，大大提高了信噪比，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单等优势，目前已广泛应用于免疫分析、临床检验、环境检测、物质分析等领域[19～22]。本研究采用3条核酸链构建DNA夹心结构，使用λexo进行目标DNA的辅助放大，建立了新型化学发光传感器，成功实现了DNA检测。本方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优势，可用于实际样品分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LS-55型发光光度计（美国Perkin-Elmer公司）；PHSJ-4A型pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供（序列见表1）。Luminol、H2O2（国药上海试剂公司）；血红素（Hemin）、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）购于美国Sigma公司；λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）、10×λexo反应缓冲液（0.67 mol/L Glycine-KOH（pH 9.4，25℃），0.02 mol/L MgCl2，500 μg/mL BSA）购于美国New England Biolabs公司。其它试剂均为国产分析纯，实验用水为18.2 MΩ·cm的超纯水。2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH缓冲液（pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0），含0.05%（w/V）Triton X-100，1%（V/V）DMSO，2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl。

2.2 实验方法

2.2.1 DNA的检测 将浓度均为1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同浓度的Target DNA在95℃下加热10 min，再自然冷却到室温。

取出20 μL不同浓度的Target DNA与10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA，在37℃杂交2 h；杂交完成后，加入5 μL λexo （2 U/μL）及5 μL 10 × λexo反应缓冲液，在37℃下温育30 min。随后，将上述混合溶液加热到75℃，保持10 min，再冷却至37℃，孵育1 h；加入10 μL Hairpin DNA，在37℃孵育30 min，再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin（终浓度为2.0×107 mol/L）及820 μL HEPES-NH4OH缓冲溶液，充分混匀后，在室温下孵育1 h，保证Hemin与打开的Hhairpin DNA充分反应，形成稳定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构。最后，依次将50 μL Luminol（终浓度为1.0×103 mol/L）、50 μL H2O2（终浓度为3.0×102 mol/L）加入到上述溶液中，在室温下立即测量样品的CL光谱。

2.2.2 化学发光测定

CL测量均使用光程为1 cm的比色池。电压设置为800 V，狭缝宽度设为15 nm，扫描速度为1200 nm/min，测量时关掉LS-55型发光光度计的氙灯，测定样品溶液在425 nm处的相对化学发光强度ΔI（ΔI=I-I0， I0为无Target DNA存在时Luminol的化学发光强度， I为不同浓度的Target DNA存在时Luminol的化学发光强度）。每个样品均平行测定3次。

3 结果与讨论

3.1 实验原理

实验原理如图1所示，本体系包括4种DNA：Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA。首先，Phosphate-DNA与AuxiliaryDNA及Target DNA进行杂交，形成DNA的复合结构。随后向溶液中加入λexo，由于λexo可作用于5′磷酸化的双链DNA分子，并沿5′-3′方向渐进性催化去除5′单核苷酸，破坏双链DNA结构，同时释放出Auxiliary DNA及Target DNA。释放出的Target DNA可以继续进入下一轮循环，不断产生大量Auxiliary DNA，而Auxiliary DNA可以将Hairpin DNA的茎环结构打开，打开的Hairpin DNA在血红素存在的条件下，可以形成稳定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme结构，表现出类似于过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化Luminol产生化学发光，并且Luminol产生的相对化学发光强度与目标DNA的浓度在一定范围内成比例，从而可以实现Target DNA的定量分析检测。

3.2 可行性研究

不同条件下的化学发光光谱（图2） 表明，单独的Hemin化学发光强度十分微弱（曲线a）；不加入Target DNA（曲线b）， 或者不加入λexo（曲线c）的情况下，体系的化学发光强度也较弱； 图2 不同体系的化学发光光谱

Fig.2 CL spectra of hemin （a）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin （b）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin （c） and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin （d and e）. Experimental conditions： 1.0×107 mol/L phosphate-DNA， 1.0×107 mol/L auxiliary DNA， 1.0×107 mol/L hairpin DNA， 5.0×1012 mol/L target DNA（curve d） and 8.0×109 mol/L target DNA（curve c and e）， 2.0×107 mol/L hemin， 10 units lambda exonuclease （λexo）， 1.0×103 mol/L Luminol， 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后，体系的化学发光强度增加，且Target DNA浓度越高，发光强度越高（曲线d和e）。化学发光强度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端，释放Target DNA，并不断进入下一循环，产生大量的Auxiliary DNA，可以与Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构。上述结果表明，本方法可用于Target DNA检测。

3.3 测定条件的优化

3.3.1 λexo用量对体系化学发光强度的影响 由于λexo用量直接影响目标DNA的循环效果，进而影响检测体系的化学发光信号的强弱，因此实验首先考察了λexo用量对体系化学发光强度的影响（图3），结果表明，体系的化学发光强度随着λexo用量的增加而逐渐增强，并且当λexo的用量达到10 units 时，体系的化学发光强度趋于稳定。因此，实验将λexo的最佳用量定为10 units。

3.3.2 pH值对体系化学发光强度的影响 由于体系的化学发光强度与缓冲介质的pH值之间存在一定关系[6，16]，因此考察了不同pH条件对体系化学发光强度的影响。实验结果如图4所示，所用HEPES-NH4OH缓冲溶液使体系pH值从7.4逐渐增加到9.0时，体系的化学发光强度逐渐增强，且在pH=9.0时达到最大值；之后继续增大pH值，体系的化学发光强度逐渐减弱。最终选择pH=9.0的HEPES-NH4OH缓冲溶液作为最佳缓冲条件。

3.3.3 Luminol浓度对体系发光强度的影响 作为化学发光的底物，Luminol的浓度强烈影响体系的化学发光强度。本研究考察了不同浓度的Luminol对体系化学发光强度的影响，实验结果如图5所示。在0.4～1.0 mmol/L的浓度范围内，随着Luminol浓度的增加，体系的化学发光强度逐渐增强，且在Luminol浓度为1.0×103 mol/L时，发光强度达到最大值；之后继续增大Luminol的浓度，体系的化学发光强度反而呈现下降趋势。因此选择Luminol的最佳浓度为1.0 mmol/L。

3.3.4 H2O2浓度对体系化学发光强度的影响 考察了化学发光的氧化试剂H2O2的浓度对体系化学发光强度的影响示。从图6可见，H2O2浓度在5.0～30 mmol/L范围内，随着H2O2浓度增加，体系的化学发光强度逐渐增强；当H2O2浓度在30～50 mmol/L时，体系的化学发光强度逐渐减弱。为了获得较大的化学发光强度，实验选择H2O2的最佳浓度为30 mmol/L。

3.4 灵敏度的考察

在优化的实验条件下，测定目标 DNA浓度与体系的化学发光强度之间的关系（图7和图8）。从图7可见， Luminol的化学发光强度随着目标DNA浓度的增加而不断增强，并且Luminol的相对化学发光强度ΔI与目标DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L浓度范围内呈现良好的线性关系（图8），检出限为0.7×1013 mol/L（3σ）。与文献报道的方法比较（表2）可见，本方法的灵敏度优于文献报道的光学检测方法， 或与之相当。

3.5 特异性的考察

为考察所建立方法的特异性，选择浓度均为8.0×108 mol/L的随机序列DNA片段、单碱基错配的DNA片段， 以及三碱基错配的DNA片段作为对照样品，与8.0×109 mol/L目标DNA进行分析比较。从图9可见，仅有完全互补的目标DNA存在时，才能使体系的化学发光强度显著增加；相比之下，其它几种DNA的化学发光强度很低。结果表明，构建的化学发光传感器具有很好的特异性，可以区分不同错配的DNA序列。

3.6 实际样品的测定

为了考察所建立的方法检测复杂生物样品的可行性，进行了人血清样品中的标准添加实验。人血清样品稀释100倍进行加标分析。从图10可见，目标DNA在人血清样品中的化学发光强度值与其在缓冲溶液中的化学发光强度值基本一致，表明通过样品稀释可以有效降低复杂样品的基质的影响。结果表明，本方法在复杂生物样品的分析方面具有潜在的应用价值。

4 结 论

本研究发展了一种基于λexo辅助放大和G-Quadruplexes/hemin DNAzyme催化放大的简单、快速的传感新方法，成功实现了目标DNA在缓冲溶液和复杂生物样品中的高灵敏检测。本方法具有独特的优势：与传统的光学分析方法相比，本方法不需要标记任何发光基团，分析成本低；整个检测过程都是在均相溶液中进行，无需经过洗涤、分离等繁琐的操作步骤，简单方便；本方法具有很高的灵敏度和特异性；本方法对目标DNA的检测具有良好的通用性，通过改变Phosphate-DNA的碱基序列很容易应用于其它目标DNA的检测，具有潜在的应用价值。

References

1 LI Min-Jie， WU Yi-Ping， ZHANG Bin-Tian， GUO Liang-Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（7）： 965-972

李敏杰， 吴一萍， 张斌田， 郭良宏. 分析化学， 2013， 41（7）： 965-972

2 Turner E H， Ng S B， Nickerson D A， Shendure J. Genomics Hum. Genet， 2009， 10： 263-284

3 Gresham D， Ruderfer D M， Pratt S C， Schacherer J， Dunham M J， Botstein D， Kruglyak L. Science， 2006， 311（5769）： 1932-1936

4 Saiki R K，Gelfand D H， Stoffel S， Scharf S J， Higuchi R， Horn G T， Mullis K B， Erlich H A. Science， 1988， 239（4839）： 487-491

5 Ye S， Yang Y， Xiao J， Zhang S. Chem. Commun.， 2012， 48： 8535-8537

6 Chen J， Huang Y，Vdovenko M， Sakharov I Y， Su G. Zhao S. Talanta， 2015， 138： 59-63

7 Kong R M， Zhang X B， Zhang L L， Huang Y， Lu D Q， Tan W， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.， 2011， 83（1）： 14-17

8 GUO Qiu-Ping， ZHAO Xia-Yu， XIE Qin， WANG Ke-Min， WAN Jun， YUAN Bao-Yin， TAN Yu-Yu. Chem. J. Chinese Universities， 2014， 35 （8）： 1646-1651

郭秋平，赵下雨，谢 琴， 王柯敏， 万 俊， 袁宝银，谭誉宇. 高等学校化学学报， 2014， 35 （8）： 1646-1651

9 Huang Y， Chen J， Shi M， Zhao S， Chen Z F， Liang H. J. Mater. Chem. B， 2013， 1： 2018-2021

10 He H Z， Leung K H， Wang W， Chan D S H， Leung C H， Ma D L. Chem. Commun.， 2014， 50： 5313-5315

11 Zhu Z M， Yu R Q， Chu X. Anal. Methods.， 2014， 6： 6009-6014

12 ZHENG Ai-Hua， ZHU Qing， XIANG Dong-Shan， HE Zhi-Ke. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 325-329

郑爱华，朱 庆，向东山，何治柯. 分析化学， 2013， 41（3）： 325-329

13 Lin L， Liu Y， Zhao X， Li J. Anal. Chem.， 2011， 83（22）： 8396-8402

14 Liu L， Lei J， Gao F， Ju H. Talanta， 2013， 115： 819-822

15 Huang Y， Chen J， Zhao S， Shi M， Chen Z F， Liang H. Anal. Chem.， 2013， 85（9）： 4423-4430

16 Chen J， Qiu H， Zhang M， Gu T， Shao S J， HuangY， Zhao S. Biosens. Bioelectron.， 2015， 68： 550-555

17 Zheng A X， Li J， Wang J R， Song X R， Chen G N， Yang H H. Chem. Commun.， 2012， 48： 3112-3114

18 Wang F， Lu C H， Willner I. Chem. Rev.， 2014， 114 （5）： 2881-2941

19 Zhao L， Sun L， Chu X. TrAC-Trend. Anal. Chem.， 2009， 28（4）： 404-415

20 Luo M， Chen X， Zhou G， Xiang X， Chen L， Ji X， He Z. Chem. Commun.， 2012， 48： 1126-1128

21 Freeman R， Liu X， Willner I. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（30）： 11597-11604

22 Zhang L， He N， Lu C. Anal. Chem.， 2015， 87（2）： 1351-1357

23 Liu P， Yang X， Sun S， Wang Q， Wang K， Huang J， Liu J， He L. Anal. Chem.， 2013， 85（16）： 7689-7695

24 Liu X， Aizen R， Freeman R， Yehezkeli O， Willner I. ACS Nano.， 2012， 6（4）： 3553-3563

25 Huang J， Su X， Li Z. Anal. Chem.， 2012， 84（14）： 5939-5943