环磷酰胺小鼠少精子模型的构建及枸杞煎提液的治疗作用*

许 卫 楼哲丰 金江涛 王琼丹 蒋亦雯 韩 奔 金龙金

温州医科大学检验医学院、生命科学学院, 浙江省医学遗传学重点实验室（温州 325035）

·论 著·

环磷酰胺小鼠少精子模型的构建及枸杞煎提液的治疗作用*

许 卫△楼哲丰△金江涛 王琼丹 蒋亦雯 韩 奔 金龙金**

温州医科大学检验医学院、生命科学学院, 浙江省医学遗传学重点实验室（温州 325035）

目的 研究环磷酰胺（CP）小鼠少精子模型的构建方法，以及评价枸杞煎提液对少精子症的治疗作用。方法 小鼠分别以60、80、100mg/kg CP腹腔注射，qid，连续5d，测定精子相对数和睾丸组织切片，得出最适CP剂量；再以高低剂量（20g/kg、10g/kg）枸杞煎提液给最适CP剂量构建的少精子小鼠灌胃14d，测定精子相对数、睾丸组织切片和流式细胞仪检测生精细胞倍性。结果 3种剂量CP处理组精子相对计数、生精小管面积、直径、生精上皮细胞层数（CMSE）均显著低于空白对照组和生理盐水组（P＜0.001）；枸杞高低剂量组精子相对计数、生精小管面积、直径、CMSE显著高于阳性对照组（P＜0.001）；枸杞高剂量组与阳性对照组比在单倍体细胞（1C细胞）比例上显著降低，四倍体细胞（4C细胞）比例上显著升高（P＜0.05），枸杞低剂量组与阳性对照组比在二倍体细胞（2C细胞）比例上显著升高（P＜0.05）。结论 60mg/kg CP为构建小鼠少精子模型的适宜剂量；枸杞煎提液对少精子症有一定治疗效果，可能与促进4C细胞增殖有关。

少精子症； 疾病模型, 动物； 枸杞

环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是一种烷化剂，能够损害男性生殖系统［1］，使精子形态异常，数目减少，活力降低［2］，以其构建的少精子模型已逐渐用于实验研究。枸杞常被用作补肾益气，具有保护睾丸功能的作用。本实验以不同剂量的CP构建小鼠少精子模型，筛选出最适CP剂量，然后用枸杞煎提液治疗最适CP剂量构建的小鼠少精子模型，以研究CP小鼠少精子模型的构建方法，以及评价枸杞煎提液对少精子症的治疗作用。

材料与方法

一、实验动物

清洁级雄性ICR小鼠80只，4周龄，体重18～22g（购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证：SCXK（沪）2012-0002）。

二、主要试剂

苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），环磷酰胺（Alfa Aesar），枸杞。

三、实验方法

（一）不同浓度CP构建少精子模型

1. 分组和给药：将40只小鼠随机分为5组（每组8只）：空白对照组（Ⅰ组）、生理盐水组（Ⅱ组：生理盐水）、低剂量CP组（Ⅲ组：60mg/kg CP）、中剂量CP组（Ⅳ组：80mg/kg CP）、高剂量CP组（Ⅴ组：100mg/kg CP），每天腹腔注射1次，每次0.5mL，连续5d，饲养至第33d处死。

2. 附睾尾精子计数：取附睾尾，置于1mL PBS，剪碎，静置15min，振荡摇匀，静置3min，取上清液；500μL PBS，振荡摇匀，静置3min，取上清液，重复一次；加1mL精子固定液，静置3min，血细胞计数板计数。

3. 睾丸石蜡切片观察生精小管直径、面积、生精上皮细胞层数（CMSE）：取左侧睾丸，常规石蜡包埋，HE染色。每个睾丸制作2张切片，每张切片随机取4个高倍镜视野，Image pro plus 6.0处理图像。

（二）枸杞煎提液治疗少精子模型

1. 枸杞煎提液制备：参照汪君民等［3］制备方法，用9倍体积水浸泡30min，加热至沸腾，煎煮10min，取药液；药渣加7倍体积水，煎煮10min过滤，两液混合、浓缩。

2. 分组和给药：将40只ICR雄性小鼠随机分为4组（每组10只）：阴性对照组（A组）、阳性对照组（B组）、枸杞低剂量组（C组）、枸杞高剂量组（D组）。A组腹腔注射生理盐水，B、C、D组腹腔注射60mg/kg CP，每天1次，每次0.5mL，连续5d。第6d起A、B组生理盐水灌胃，C、D组分别予10、20g/kg枸杞煎提液灌胃，每天1次，每次0.5mL，连续14d，饲养至第33d处死。

3. 附睾尾精子计数（同前）。

4. 睾丸石蜡切片观察生精小管直径、面积、CMSE（同前）。

5. 流式细胞术对中药治疗小鼠进行生精细胞倍性分析：右侧睾丸去包膜，剪碎，2ml PBS，1000r/ min 2min，取上清，3000r/min 4min，弃上清。按照细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用DNAMultiCycle软件进行统计拟合分析。

（三）实验计算方法

1. 精子悬液的精子数目（总精子数）=80小格内的精子数/80×400×10000×稀释倍数

2. 精子相对计数（精子数/100mg附睾尾重）=附睾尾精子总数/附睾尾重（mg）×100

三、统计学处理

所有数据以均数±标准差表示，组间比较应用单因素方差（One-way ANOVA）分析，采用SPSS16.0软件进行统计学处理。

结 果

一、不同浓度CP构建少精子模型

（一）CP对小鼠精子相对计数的影响

各实验组连续注射不同剂量CP后，精子相对计数值显著低于Ⅰ组和Ⅱ组（P＜0.001）。随着CP剂量的增加，精子相对计数逐渐减少。其中Ⅴ组精子数过少，无法计数（见表1）。

（二） CP对小鼠睾丸组织的影响

Ⅰ组和Ⅱ组生精小管细胞排列紧密有序，结构清晰，层次分明，可见各级生精细胞和精子，间质细胞紧密聚集于生精小管之间的疏松组织内（见图1A和图1B）。Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组生精小管基底膜变薄，生精细胞数目及层次明显减少，排列紊乱，甚至脱落、消失，管腔内精子少见，间质内细胞数目明显减少，间质变大，各指标损伤程度Ⅴ组＞Ⅳ组＞Ⅲ组（见图1C、图1D和图1E）。

表1 不同浓度CP对小鼠附睾尾重及精子相对计数值的影响（s）

表1 不同浓度CP对小鼠附睾尾重及精子相对计数值的影响（s）

注： 与Ⅰ组比, *P＜0.001； 与Ⅱ组比, △P＜0.001

组别 n 附睾尾重（g） 精子相对计数值（107/100mg）Ⅰ组 8 0.0307±0.0026 2.1490±0.3000Ⅱ组 8 0.0321±0.0032 2.1450±0.1910Ⅲ组 8 0.0230±0.0026 0.2352±0.0943*△Ⅳ组 8 0.0261±0.0020 0.0798±0.0405*△Ⅴ组 8 0.0223±0.0037 精子过少, 无法统计

各实验组生精小管面积、直径、CMSE均显著低于空白对照组和生理盐水组（P＜0.001）（见图2）。

二、枸杞煎提液治疗少精子模型

（一）枸杞煎提液对模型小鼠精子相对计数的影响

C组和D组精子相对计数显著高于B组（P＜0.001）。B组、C组和D组精子相对计数显著低于A组（P＜0.001）（见表2）。

图1 不同剂量CP对小鼠睾丸组织的影响（×400）A：空白对照组，B：生理盐水对照组，C：低剂量CP组，D：中剂量CP组，E：高剂量CP组

图2 不同浓度CP对小鼠生精小管直径、面积、CMSE的影响（s）注： 与Ⅰ组比, aP＜0.001； 与Ⅱ组比, bP＜0.001

表2 中药治疗对小鼠睾丸尾重及精子相对计数的影响（s）

表2 中药治疗对小鼠睾丸尾重及精子相对计数的影响（s）

注： 与A组比, *P＜0.001；与B组比, △P＜0.001

组别 n 附睾尾重（g） 精子相对计数（107/100mg）A 10 0.0322±0.0025 2.1055±0.2776 B 10 0.0273±0.0026 0.2282±0.0122* C 10 0.0294±0.0036 1.1466±0.0204*△D 10 0.0279±0.0034 1.1494±0.0269*△

（二）枸杞煎提液对模型小鼠睾丸组织的影响

A 组生精小管内细胞排列紧密有序，结构清晰，层次分明，可见各级生精细胞和精子，间质细胞紧密聚集于生精小管之间的疏松组织内（见图3A）。B组生精小管基底膜变薄，生精细胞数目及层数明显减少，排列紊乱，甚至脱落、消失，管腔内精子少见，间质内细胞数目明显减少，间质变大（见图3B）。C组生精小管内细胞排列较为紧密，基本上可以分辨出各级生精细胞，数目增多，排列较规则，层次较分明，间质内细胞增多（见图3C）。D组生精小管内细胞排列紧密、有序，结构清晰，可以清晰的分辨出各级生精细胞，数目增多，排列规则，层次分明，间质细胞紧密聚集于生精小管之间的疏松组织内（见图3D）。

C组和D组生精小管面积、直径、CMSE均显著高于B组（P＜0.001），D组除层数外其它两项指标恢复至与阴性对照组相近，比较无统计学意义（P＞0.05）（见图4）。

（三）枸杞煎提液对模型小鼠生精细胞倍性的影响

B组在1C、2C细胞比例上与A组比有显著性差异（P＜0.05），D组与B组比在1C细胞比例上显著降低，4C细胞比例上显著升高（P＜0.05），C组与B组比在2C细胞比例上显著升高（P＜0.05）（见图5）。

图4 枸杞煎提液对模型小鼠生精小管直径、面积、CMSE的影响（s）注： 与A组比, aP＜0.001； 与B组比, bP＜0.001

图5 枸杞煎提液对模型小鼠生精细胞倍性的影响注： 与A组比, aP＜0.05；与B组比, bP＜0.05

讨 论

CP是临床上常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，长期使用会损害生殖系统［4］。用CP构建动物模型有利于探究相关机制和寻求可能的防治方法。Elangovan等［5］认为，低剂量CP会暂时性干扰正常雄性小鼠生殖系统，而高剂量CP会使生殖系统产生永久性的功能障碍，但对具体的剂量并没有明确说明。目前对于能建立稳定的小鼠少精子模型CP剂量也很少有报道。本实验中，用不同剂量CP对小鼠染毒，均成功建立了小鼠少精子模型，且相对精子计数随着CP剂量的增加逐渐减少，少精子程度加重。80mg/kg CP组与60mg/kg CP组比较精子相对计数明显减少（P＜0.05），睾丸组织各指标损伤程度随CP剂量的增加加剧，故此，我们认为相比于80、100mg/kg CP，60mg/kg CP为构建稳定的少精子小鼠模型的适宜剂量。

生精小管直径的改变是反映精子发生状态的一个很好的指标。光镜下对各组睾丸组织HE染色切片进行观察，可见枸杞高低剂量组生精小管细胞排列紧密、有序，结构清晰，可以清晰的分辨出各级生精细胞，生精小管直径、面积、生精细胞上皮层数明显增多，而精子相对计数也较阳性对照组明显增加，表明枸杞能明显减轻小鼠睾丸组织细胞的损伤程度，修复睾丸组织的生理形态，且能促进精子的生成，起到一定的治疗效果。

睾丸生精小管中的生精细胞由精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子组成。精子的发生过程分为3个阶段：（1）精原细胞增殖时期：增殖过程中，通过精原细胞（2C）的分裂和分化，精原细胞产生初级精母细胞（4C）；（2）精母细胞成熟分裂时期：包括初级精母细胞和次级精母细胞（2C）的2次成熟分裂，即初级精母细胞经过1次DNA复制，2次细胞分裂，结果染色体减少了一半，形成精子细胞（1C）；（3）精子形成时期：由圆形的精细胞变形和浓缩为蝌蚪状的精子（1C）。

本实验中阳性对照组1C细胞比例比阴性对照组低，2C细胞比例比阴性对照组高，推测CP致少精子可能是通过损伤1C细胞，或将细胞周期阻断于G2期之后到M2末期之前的某个时期致使1C细胞比例下降，2C细胞比例上升。李晓彩［6］认为枸杞可降低生精细胞凋亡率，增加4C细胞比例，而保证生精细胞分化过程中精子细胞形成，确保单倍体成熟精子的生成数量，保证睾丸生殖功能。从图5中，我们可以看出：相比于阳性对照组，枸杞高低剂量组4C细胞比例均有一定程度的升高，推测枸杞治疗少精子的机制可能与提高4C细胞比例有关。我们发现：相比于阳性对照组，枸杞高低剂量组1C细胞比例都有所下降。结合图4，相比于阳性对照组，枸杞高低剂量组精子相对计数显著升高。我们推测：枸杞煎提液在提高4C细胞比例的同时，也促进1C细胞的增殖，但相比于4C细胞的增加量较低，因而在比例上反而降低。故此，我们认为枸杞治疗少精子的机制为：促进精原细胞分裂和分化，从而促进4C细胞的增殖，进而间接提高睾丸生精功能，使精子数增加。

综上所述，环磷酰胺能成功地构建少精子症小鼠模型，适宜剂量为60mg/kg CP。枸杞煎提液能使损伤后的雄鼠生殖系统得到一定的修复。初步推测CP能损伤1C细胞，或将细胞周期阻断于G2期到M2末期之间，枸杞治疗少精子的机制可能为促进4C细胞增殖，进而间接提高睾丸生精功能。

1 Zhang J, Tian Q, Yung Chan S, et al. Metabolism and transport of oxazaphosphorines and the clinical implications. Drug Metab Rev 2005； 37（4）： 611-703

2 Alvarez JG, Storey BT. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev 1995； 42（3）： 334-346

3 汪君民, 郭朝霞, 袁礼峰. 枸杞对运动大鼠肾脏凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达及血管紧张素的影响. 山东体育学院学报 2010； 26（10）： 49-55

4 Hoorweg-Nijman JJ, Delemarre-van de Waal HA, de Waal FC, et al. Cyclophosphamide-induced disturbance of gonadotropin secretion manifesting testicular damage. ACTA Endocrinol （Copenh） 1992； 126（2）： 143-148

5 Elangovan N, Chiou TJ, Tzeng W F, et al. Cyclophosphamide treatment causes impairment of sperm and its fertilizing ability in mice. Toxicology 2006； 222（1-2）： 60-70

6 李晓彩. 枸杞多糖对双酚A所致小鼠睾丸生精细胞凋亡的保护作用研究. 保定： 河北农业大学硕士学位论文, 2012

（2015-04-08收稿）

Establishment of cyclophosphamide-induced oligopermia mouse model and the curative effect of Matrimony vine*

Xu Wei△, Lou Zhefeng△, Jin Jiangtao, Wang Qiongdan, Jiang Yiwen, Han Ben, Jin Longjin**
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics,School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
Corresponding author： Jin Longjin, E-mail：1304071636@qq.com

Objective To establish Cyclophosphamide（CP）-induced oligopermia mouse model and evaluate the curative effect of Matrimony vine on oligospermia. Methods Male mice were intraperitoneally injected with CP of 60, 80, 100mg·kg-1·d-1 for 5 day, then they were comparatively analyzed by means of epididymal sperm count, paraffi n sections of testis for a suitable CP dose. The established oligospermia mouse models which were induced by the most suitable CP dose were intragastrically administrated with high and low doses of Matrimony vine （20g/kg, 10g/kg） for 14d, and then epididymal sperm count, paraffi n sections of testis and Spermatogenic cells test were analyzed respectively. Results Globus minor relative sperm count, area and diameter of seminiferous tubules, count measure spermatogenic epithelium （CMSE） in three doses of CP group were all signifi cantly lower than those in the blank control group and saline group （P ＜0.001）； In high and low doses of Matrimony vine groups, area and Globus minor relative sperm count and diameter of seminiferous tubules, CMSE were all significantly higher than those of the positive control group （P＜0.001）； the wolfberry high dose group was lower than the positive control group in the proportion of 1C cells and higher in the proportion of 4C cells （P＜0.05）； The wolfberry low dose group was higher than the positive control group at the ratio of 2C cells （P＜0.05）. Conclusion The dose of 60mg/kg is the best for establishment of oligopermia mouse model. Matrimony vine has therapeutic effects on model mice which may be associated with an increase in the number of tetraploid cells.

oligospermia； disease models, animal； Lycium barbarum

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.10.001

R 698.2

△共同第一作者

资助： 2014国家级大学生创新创业训练计划项目（20140343015）

**通迅作者, E-mail： 1304071636@qq.com