自噬在银屑病角质形成细胞中的水平及病理意义

潘之 马天骄 肖辉 赵敏 马燕雪 杨桂兰

自噬在银屑病角质形成细胞中的水平及病理意义

潘之 马天骄 肖辉 赵敏 马燕雪 杨桂兰

自噬是真核细胞中普遍存在的现象，自噬水平的异常已被证明与诸多疾病存在关联。研究表明，自噬水平下降与细胞异常增殖、分化及炎症密切相关，而银屑病皮损中存在细胞增殖、分化与免疫调节异常，表明银屑病发病机制与角质形成细胞自噬水平异常可能存在一定的联系。近年来的研究提示，银屑病角质形成细胞中自噬的水平异常可能参与了银屑病病理机制的形成。概述自噬与细胞增殖、分化及炎症的关系、银屑病角质形成细胞的病理状态以及正常角质形成细胞与银屑病角质形成细胞中的自噬的相关研究。

银屑病；自噬；角蛋白细胞；病理学

本文主要缩写：LC3：微管相关蛋白轻链3，Atg：自噬相关基因，CCL：趋化因子配体，GFP：绿色荧光蛋白常，这些研究提示自噬水平异常可能在银屑病发病机制中发挥了一定作用。

1 自噬与细胞增殖、分化及炎症的关系

1.1 自噬与细胞增殖：研究表明，自噬与细胞增殖存在联系。Eskelinen等［5］的研究发现，在体外培养的动物细胞（包括正常鼠肾脏细胞、HeLa细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等）中，自噬泡的形成由细胞周期严格控制。他们发现在由诺考达唑（nocodazole）导致的细胞分裂停滞在前中期时，自噬泡的形成被明显抑制，这种状态在分裂中期及后期也会出现，并且营养缺乏并不能使分裂间期细胞的自噬增加，但自噬泡在细胞分裂末期核膜封闭后又会重新出现。从而认为有丝分裂强烈抑制自噬。

Wang等［6］认为，可能存在一种有效的机制将自噬与细胞生长（包括细胞增大及分裂）联系起来，其中之一水平上升可引起另一种水平下降，由此防止营养与能量的浪费。自噬可以抑制细胞生长并促进细胞在应激状态下存活。Fimia等［7］利用大鼠模型实验表明，自噬相关蛋白（如Ambra1）的缺失可导致细胞增生加快。自噬的减少可能会导致不正常的细胞周期调控因子如周期素依赖性蛋白激酶抑制因子的产生，使细胞进入不正常的细胞周期［6］。

在涉及角质形成细胞的研究中，Lee等［8］研究表明，巨噬细胞活化脂肽2诱导角质形成细胞增殖后，抑制支架蛋白p62的表达，引起了呈时间依赖性的角质形成细胞的增殖抑制。此外，用对p62特异的shRNA转染人原代角质形成细胞可显著减少细胞周期素D1、细胞周期素依赖性激酶4和Akt（即蛋白激酶B）的磷酸化作用，提示p62在角质形成细胞增殖及细胞周期进程起重要作用。研究还证明，自噬与p62的表达负相关，提示自噬可抑制角质形成细胞增殖。

1.2 自噬与细胞分化：自噬与细胞分化间的关系尚未完全阐明。微管相关蛋白轻链3（LC3）及LC3-Ⅱ被认为是自噬的特异标记物，LC3在细胞自噬的过程中起作用，并可进一步生成LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可附着于自噬体上。研究证明，在一些应激条件下，如细胞饥饿、缺氧等，LC3及LC3-Ⅱ的水平可升高［9］。

Salemi等［10］利用透射电镜发现，相比 NB4 细胞，在表皮干细胞、真皮干细胞和造血干细胞中，有大量自噬泡存在。利用共聚焦显微镜发现，在NB4细胞有微弱而分散的LC3及自噬相关基因（Atg）5的表达，而在以上3种干细胞中显示更多的光斑。用免疫印迹法检测干细胞中有LC3-II，但无p62表达，在分化不成熟的此类细胞中，有p62和相对较少的LC3-II表达，在分化的细胞中还有更少的Atg-5和Beclin1表达。使用Atg-5 shRNA阻断自噬的形成，导致了这些干细胞自我更新的能力下降。使用3甲基腺嘌呤和Atg-5 shRNA阻滞自噬会导致3种干细胞分化能力下降。总之，成人皮肤及造血干细胞的自噬水平降低可导致其自我更新和分化的能力下降。在自噬被抑制时，这些细胞将不再显示出多向分化的潜质。

在涉及角质形成细胞的研究中，Rossiter等［11］利用HE染色、透射电镜、免疫染色、Western印迹等技术发现，Atg-7表达缺陷的小鼠除了背部角质形成细胞层增厚之外，耳与尾部的角质形成细胞的角化完全正常。此外Atg-7表达缺陷的小鼠表皮中的自噬抑制并没有打乱角质形成细胞中角蛋白5、角蛋白6、角蛋白10和丝聚合蛋白等分化标记物的表达。研究提示，有自噬现象的角质形成细胞和自噬缺陷的角质形成细胞的分化差异较小。

在Haruna等［12］使用钙离子诱导人类正常角质形成细胞分化后，采用Western印迹和免疫组化的方法检测LC3水平，发现诱导分化后7 d内的LC3水平升高呈时间依赖性。细胞被收集前的6 h和24 h在诱导分化的角质形成细胞中加入E64d和胃酶抑素A（溶酶体蛋白酶抑制剂）后，自噬对LC3-Ⅱ的降解被明显抑制。与未分化的状态相比，分化的角质形成细胞中LC3-Ⅱ聚集更明显。使用免疫荧光技术发现培养的角质形成细胞在诱导分化的7 d后，LC3阳性光斑明显增多，提示与未分化的角质形成细胞相比，分化的角质形成细胞中有更多的自噬体聚集。

1.3 自噬与炎症：近年来的研究表明，自噬在炎症调控、感染控制、对病原体的免疫反应中作用显著，这些研究提示，自噬是疾病病理机制的重要调节因素。自噬的细菌清除作用，可能在细菌感染性疾病中具有保护作用。在涉及炎症损伤的研究表明，自噬可能具有下调促炎症细胞因子的功能，可能在细菌感染的炎症性疾病中具有保护作用［13］。

在涉及角质形成细胞的研究中，Lee等［8］发现，对自噬的阻断会显著增强人角质形成细胞中炎症因子和支架蛋白p62的表达。在角质形成细胞中，使用3甲基腺嘌呤和巴佛洛霉素A1分别干扰早期和晚期自噬，或使用针对重要Atg的siRNA（如巴佛洛霉素A1，hAtg5）阻断Atg表达后，炎症反应会增强，细胞增殖也会增加。他们发现，用特定的siRNA阻断p62的表达后，减少了角质形成细胞中炎症因子相关基因和抑菌肽的表达，并延缓了细胞增殖，减轻了核因子κB启动因子的作用。已有证据表明，自噬通过调控重要的衔接蛋白（如p62）的效应调控细胞稳态和信号通路［14］。还有研究表明，对自噬抑制造成了转染细胞中p62的聚集，可与清除泛素-蛋白酶体底物的作用相抵消［15］。p62是自噬在细胞内的重要吞噬目标。

2 银屑病角质形成细胞的病理状态

2.1 银屑病角质形成细胞的增殖：角质形成细胞的细胞周期缩短、增殖加速是银屑病的重要机制。在Weinstein 和 Frost［16］利用放射性自显影技术发现，银屑病皮损的细胞周期明显缩短，他们检测出了分裂的角质形成细胞各期的时间，发现正常表皮细胞与银屑病表皮细胞的细胞周期时间差异主要在G1期，其余各期差异相对较小。表明在银屑病皮损中，有丝分裂的细胞增多，细胞周期缩短，增殖加速。

2.2 银屑病角质形成细胞的分化：银屑病皮损中存在分化不完全的角质形成细胞，银屑病皮损鳞屑即是由未完全分化的角质形成细胞构成的角质层，在这些细胞中细胞核依然残存。正常角质形成细胞终末分化由表皮颗粒层开始，但在银屑病皮损中颗粒层明显变薄甚至消失。在银屑病中还存在多种分化标志物的异常表达，如过度增殖相关的角蛋白6和16、基底层特异表达的角蛋白5、14表达增加。而与细胞成熟相关的角蛋白1和10减少并延迟表达。此外尚有微弱而分散的源自透明角质的丝聚合蛋白表达［17］。

2.3 银屑病角质形成细胞与炎症：银屑病是免疫介导的，以过度增殖为特点的炎症性疾病。引起银屑病皮损的是由不同类型细胞相互作用形成的复杂慢性炎症网络。一旦银屑病皮损临近具有异常遗传基础的T细胞被激活，一个由细胞因子、趋化因子及生长因子组成的复杂网络就会启动，形成恶性循环，使T细胞和树突细胞被反复激活。最终表皮增厚、鳞屑产生、血管增生形成斑块，与之相伴随的是CD8+T细胞和中性粒细胞浸润。但目前对于银屑病皮损过程中T细胞激活的确切机制尚不明确。已证明多种炎症因子、趋化因子及生长因子参与了银屑病的形成，细胞因子包括肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白细胞介素（IL）1、IL-8等，趋化因子包括趋化因子配体（CCL）3、CCL4、CCL5 等，生长因子包括转化生长因子α、胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子等［18］。近年来，银屑病发病机制中的IL-17、IL-22、IL-23、核因子 κB 等因子［19］是研究的热点。

3 正常角质形成细胞与银屑病角质形成细胞中的自噬

3.1 自噬在正常角质形成细胞中的可能状态：用绿色荧光蛋白（GFP）转染LC3后，使用荧光显微镜定位LC3是重要的自噬检测方法［10］。而目前已培育出了GFP-LC3转基因鼠，可作为研究自噬的动物模型［20］。Rossiter等［11］利用 Cre/LoxP 技术使 GFP-LC3转基因的鼠系与Atg7表达缺陷的鼠系杂交，培育出了GFP-LC3 Atg7Δepi小鼠与GFP-LC3 Atg7 F/F小鼠，并使用Western印迹及荧光分析分别检测LC3与GFP-LC3，发现无Atg7表达缺陷的小鼠表皮中的自噬持续活跃，反之Cre/LoxP技术可使小鼠表皮中Atg7的表达显著下降，使自噬体的形成受阻，提示自噬在正常角质形成细胞中持续活跃。

3.2 自噬在银屑病角质形成细胞中的状态及作用：Haruna等［12］检测出了银屑病皮损中LC3与正常表皮相比水平下降。认为皮肤颗粒层的自噬可能对于角质形成细胞正常分化起到了一定作用。

在Lee等［8］的研究中，发现自噬通过支架蛋白p62负向调节银屑病角质形成细胞的炎症反应，对于阻止人类角质形成细胞中过度的炎症反应和诱导产生抑菌肽至关重要。他们发现，阻断自噬的形成，使得人角质形成细胞中炎症因子和p62表达显著上升，从反面证明了自噬对于角质形成细胞中的p62和炎症的抑制作用。通过RNA干扰抑制p62表达减少了角质形成细胞中核因子κB的激活、炎症因子的产生、抑菌肽的表达和细胞增生。进一步发现，在银屑病表皮中表达的p62与正常皮肤相比明显下降。

4 结语

银屑病皮损中存在复杂的炎症网络，正常分化的角质形成细胞中有更多的自噬体聚集，而银屑病角质形成细胞未完全分化，均提示自噬可能在银屑病角质形成细胞中水平下降。在直接涉及自噬与银屑病的研究中，Haruna等［12］证明，自噬体标志蛋白LC3的水平在银屑病皮损中下降，并认为表皮颗粒层的自噬可能对角质形成细胞正常分化起一定的作用。 Lee等［8］的研究发现，自噬通过支架蛋白p62负向调节角质形成细胞炎症反应，而p62在角质形成细胞增殖及细胞周期进程中起重要作用。这些研究也提示了银屑病角质形成细胞自噬水平可能下降，并与其异常增殖、分化及皮损炎症有关。自噬与银屑病角质形成细胞的研究尚待进一步深入。

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Levels of autophagy in psoriatic keratinocytes and its pathological role

Pan Zhi,Ma Tianjiao,Xiao Hui,Zhao Min,Ma Yanxue,Yang Guilan.Department of Dermatology,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command,Lanzhou 730050,China

Autophagy is a general phenomenon in eukaryotic cells,and it has turned out that dysregulated autophagy contributes to the development of many diseases.Researches have indicated that downregulation of autophagy is closely related to abnormal cell proliferation,differentiation and inflammation.It has been found that abnormal cell proliferation,differentiation and immune regulation exist in skin lesions of psoriasis.These findings suggest a link between the pathogenesis of psoriasis and dysregulated autophagy in keratinocytes,and recent studies have shown that abnormal keratinocyte autophagy may be involved in the pathological mechanism in psoriasis.This review presents recent advances in studies on the relationship of autophagy with cell proliferation,differentiation and inflammation,pathological state of psoriatic keratinocytes,autophagy in normal keratinocytes and psoriatic keratinocytes.

Psoriasis;Autophagy;Keratinocytes;Pathology

Yang Guilan,Email:drgly2006@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.010

730050兰州军区兰州总医院皮肤科

杨桂兰，Email:drgly2006@126.com

2014-04-09）

自噬是广泛存在于真核细胞中的现象，是细胞内主要的降解途径，其不仅可清除细胞内的某些物质，还可作为动态的循环机制，产生新的物质与能量，维持细胞的更新与稳态［1］。但目前对自噬的认识已从对细胞稳态的维持拓展为对生理病理过程的调控，包括自噬在炎症与应激状态下的作用［2］。已证明，自噬水平异常与诸多疾病存在联系，如阿尔茨海默病、肿瘤、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、2型糖尿病［1，3-4］。炎症、表皮过度增殖和表皮中伴有角化不全的异常分化是银屑病的发病机制中存在的既独立又相互联系的生物学过程。相关研究已表明，自噬水平下降与细胞异常增殖、分化、炎症存在关联，而银屑病角质形成细胞也存在细胞增殖、分化与免疫的异