梅毒螺旋体Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮损转录水平的研究

柯吴坚 杨慧兰 杨斌 郑和平 杨立刚 陈征宇薛耀华 任旭琦 吕萍 张晓辉 王柳苑

梅毒螺旋体Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮损转录水平的研究

柯吴坚 杨慧兰 杨斌 郑和平 杨立刚 陈征宇薛耀华 任旭琦 吕萍 张晓辉 王柳苑

目的探讨梅毒螺旋体（Tp）Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型中转录水平变化情况。方法3只新西兰白兔背部剔毛，皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10处，建立早期兔梅毒感染模型。同时于未注射部位行皮肤活检术，切取0.4 cm×0.4 cm皮肤作为阴性对照。每天观察注射部位皮肤变化情况，测量并记录皮疹大小。每隔3天切取1处注射部位0.4 cm×0.4 cm皮肤用于Tp0751和Tp0574 mRNA检测。整个实验过程30 d，共行11次皮肤活检。荧光定量PCR连续动态观察兔硬下疳皮损形成过程中Tp0751 mRNA表达的差异。结果新西兰白兔皮下注入Tp后，背部在第6天出现红色丘疹，到第19天皮疹达最大并出现溃疡，形成硬下疳。第25天，全身陆续出现播散性二期梅毒疹。Tp0574和Tp0751 mRNA水平在早期呈现上升趋势，到第15天达最高峰（与其他各时间点比较，均P＜0.05），其后迅速下降，在第27天有少许上升。标准化的Tp0751 mRNA从第15天起转录水平逐渐升高，到第24天达最高峰（P＜0.05）。结论标准化Tp0751转录水平在Tp被清除后期出现全身播散性二期梅毒疹前高表达。表明Tp0751蛋白可能参与Tp全身播散。

苍白密螺旋体；梅毒；模型，动物；兔；Tp0751蛋白

梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）感染引起的一种性传播疾病。在自然宿主中，Tp感染始于暴露的黏膜表面或表皮微损伤，随后Tp在感染入口处繁殖并通过循环系统播散全身［1］。体外研究显示，Tp可通过Tp0751蛋白黏附到宿主体内的层黏连蛋白，并经自催化裂解作用降解层黏连蛋白和纤维蛋白原［2-6］，提示Tp在感染过程中利用Tp0751在体内进行播散［2］。我们建立梅毒早期感染兔模型，连续观察Tp0751蛋白在皮损中转录水平变化情况，以期从宿主方面探讨Tp播散的机制。

一、动物来源

新西兰白兔3月龄，3 kg重，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号44002100005265。予不含抗生素的饲料和水喂养，取血清行性病研究实验室试验（VDRL）和梅毒螺旋体免疫荧光抗体试验（FTA）以排除兔梅毒螺旋体感染。将检测结果全阴性新西兰白兔3只用于后续动物实验。

二、方法

1.Tp0751序列分析和引物设计：从基因库和DNA资料库中搜索Tp0751氨基酸和核酸序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Treponema%20pallidum），用BioEdit 7.1软件（http://bioedit.software.informer.com/7.1/）对密螺旋体属的5个梅毒苍白密螺旋体（Nichols、DAl-1、Chicago、Mexico A 和SS-14）、3 个雅司苍白密螺旋体（Samoa D、CDC2 和 Gauthier）和1个未分类的类人猿密螺旋体（Fribourg-Blanc）进行多重序列比对。应用引物设计软件Primer 3：WWW primer tool（http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi）对基因库查询到Nichols株Tp0751基因序列（序列号：NC_000919.1）进行引物设计。用Restriction Mapper（http://www.restrictionmapper.org/）和NEBcutter V2.0.（http://tools.neb.com/NEBcutter2/）预判待扩增的DNA序列不被HindⅢ限制性内切酶（英国New England Biolabs公司）酶切。Tp0751正向引物：5′-ATGATACCTTCGGCGCTCTA-3′，反向引物：5′-CTATGCGCATTGCTGTTTGT-3′，扩增片段204 bp。管家基因Tp0574 正向引物：5′-CGTGTGGTATCAACTATGG-3′，反向引物：5′-TCAACCGTGTACTCAGTGC-3′，扩增片段 313 bp。Tp0574引物和质粒标准品由华盛顿大学Giacani教授馈赠。

2.Tp传代培养：取2 ml冻存的108/ml Tp Nichols Seattle株（由华盛顿大学Lukehart教授馈赠）接种于新西兰白兔双侧睾丸，每个睾丸接种1 ml。待7～10 d形成睾丸炎后，处死兔子，手术取睾丸，切碎、离心制备成108/ml菌悬液。为使Tp恢复毒力，再次按以上步骤传代于另一只新西兰白兔睾丸并提取Tp后用于建立早期梅毒兔模型。

3.早期梅毒兔模型建立：3只新西兰白兔背部剔毛，每只兔皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10处。同时于未注射部位行皮肤活检术，切取0.4 cm×0.4 cm皮肤作为阴性对照。每天观察注射部位皮肤变化情况，测量并记录皮疹大小。每隔3天切取1处注射部位0.4 cm×0.4 cm皮肤用于Tp0751和Tp0574 mRNA检测。整个实验过程30 d，共行11次皮肤活检。

4.总RNA提取和cDNA合成：用Ultraspec RNA分离液（美国Biotecx公司）从兔皮肤组织和兔睾丸提取的Nichols Seattle株菌悬液分离提取总RNA；用Turbo DNA酶（美国Ambion公司）去除总RNA中基因组DNA；用SuperScriptⅢ第1链合成系统（美国Invitrogen公司）合成cDNA，以上过程严格按试剂盒说明书操作。

5.PCR扩增Tp0751：以兔睾丸Nichols Seattle株cDNA为模板，PCR扩增Tp0751 mRNA。50 μl PCR扩增反应体系：5 μl待测 cDNA 样本、200 μmol/L dNTPs、5 μl 10 × Go Taq PCR缓冲液 （美国 Promega 公司）、1.5 mmol/L MgCl2、0.6 μmol/L Tp0751引物、0.5 U热启动Taq PCR聚合酶（美国Promega公司）。扩增条件：95℃变性 10 min；95℃ 1 min、60℃ 2 min、72℃1 min，共45个循环；最后72℃延伸10 min。扩增PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

6.Tp0751质粒标准品构建：将4 μl Tp0751 PCR扩增产物克隆至TOPO TA克隆pCR 2.1质粒（美国Life Technologies公司）。将重组质粒转化到TOP 10感受态细胞（美国Invitrogen公司）。挑选10个菌落，用常规PCR法（同上）验证转化子。取PCR验证正确的转化子摇菌过夜，Plasmid Mini试剂盒（德国Qiagen公司）提取质粒。双向DNA测序法（美国Genewiz公司）再次验证重组质粒。线性质粒经限制性内切酶HindⅢ（Promega）酶切过夜。用PCR纯化试剂盒（德国Qiagen公司）纯化酶切后质粒。NanoDrop-1000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测质粒浓度。质粒拷贝数计算公式 =［（6.02× 1023拷贝数）×（质粒浓度 g/μl）］/［扩增产物碱基数 ×（660 道尔顿/bp）］［7］。根据计算结果，10 倍倍比稀释质粒（106～ 100）拷贝数/μl。为获得可靠的标准曲线，每个不同浓度的质粒在LightCycle扩增仪（瑞士Roche公司）重复扩增6次。标准曲线最大可接受误差阈值设置为0.05。

7.实时荧光定量PCR检测Tp0751和Tp0574 mRNA：参考LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green试剂盒说明，荧光定量PCR检测早期梅毒兔模型皮损Tp0751和Tp0574转录水平。以兔睾丸Nichols Seattle株cDNA为阳性对照，以分子水（mH2O）为阴性对照。反应体系：5 μl待测cDNA 样本、1 μmol/L Tp0751 或 Tp0574 引物、4 μl 5 × Master Mix、9 μl mH2O。反应条件：95℃变性 10 min；95℃ 10 s、60℃8 s、72℃13 s，共45个循环；最后72℃延伸10 min。当每个循环扩增温度达引物采集温度（88℃）时，SYBR Green结合到双链DNA并释放荧光，在530 nm处可检测到荧光信号。每次检测均加入已知浓度的质粒标准品作为内参。每个样本重复检测3次。LightCycler software（3.5版本）分析检测结果。根据熔解曲线排除非特异性扩增和形成的引物二聚体。

图1 早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成过程 1A：皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株后第7天，背部见高出皮肤的红色小丘疹；1B：第21天，背部红色丘疹增大，正中出现溃疡；1C：第30天，背部丘疹变平，溃疡结痂消失；1D：第25天，背部出现播散性淡红色斑丘疹；1E：第28天，背部播散性斑丘疹变大、颜色加深

三、结果

1.Tp0751序列分析结果：从基因库中搜索到9个密螺旋体的Tp0751氨基酸和核酸序列进行多重序列比对，结果显示，9个密螺旋体的Tp0751的基因序列完全一致，并未出现基因突变、插入或缺失等情况。

2.早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成过程：予兔背部皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，第6天，可见直径0.5 cm、边界清楚、质地略硬的红色小丘疹。随着时间增加，丘疹逐渐增大、高出皮肤，颜色加深。到第19天时，皮疹增大到直径2.1 cm，正中出现直径0.2 cm溃疡。持续4～5 d后，皮疹逐渐变小，颜色变淡，溃疡处结痂、消失（图1A～1C）。从第25天起（图1D），兔模型全身陆续出现散在的浅红色的播散性二期梅毒疹。随着时间的增加，红色丘疹逐渐加深、变大、高出皮肤（图1E），5～7 d后变平并消失。

3.实时荧光定量PCR检测Tp0751和Tp0574 mRNA水平：制备的Tp0751质粒标准品其拷贝数达5.85×109拷贝/μl，予10倍倍比稀释建立标准曲线后，分别对Tp早期兔模型不同时间皮损Tp0574和Tp0751 mRNA进行动态表达水平检测，发现二者的mRNA水平呈现逐渐上升，到第15天达最高峰后迅速下降，随后在第27天又有小幅上升。各时间点Tp0574和Tp0751 mRNA水平经One-Way ANOVA分析比较，差异有统计学意义（分别F=14.54、9.677，均P＜0.000 1）。用SNK法对各时间点均值间两两比较，在第15天Tp0574和Tp0751转录水平均达最高（P＜0.05）。见表1。

将Tp0751 mRNA荧光定量PCR检测结果与Tp管家基因Tp0574进行定量比较，最终获得标准化Tp0751 mRNA动态表达水平。经One-Way ANOVA分析比较，各时间点转录水平差异有统计学意义（F=4.367，P=0.0003）。各时间点均值间两两比较，标准化Tp0751转录水平在早期呈持续稳定表达，从第15天起，其转录水平呈上升趋势，在第24天也即出现二期全身播散性梅毒疹前1天，达最高峰（P＜0.05），随后呈下降趋势。

四、讨论

多种病原体通过细胞外基质（ECM）层黏连蛋白侵入附着到宿主组织［5］。对Tp基因组预测的编码外膜蛋白的开放阅读框（ORF）进行分析，并重组表达这些蛋白质发现，Tp外膜蛋白Tp0751具有黏附层黏连蛋白功能［6］。进一步研究显示，Tp0751 可黏附到层黏连蛋白 1、2、4、8、10 亚型［5］。感染过程中，当高度侵袭性病原体的黏附素遇到宿主体内各种组织时，这种广泛的黏附功能将发挥其普遍黏附作用［5］。与其他侵袭性病原体（如肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌等）相似，Tp可表达Tp0751蛋白，该蛋白可结合并降解人纤维蛋白原和层黏连蛋白［2-3］。Houston 等［3］对 Tp0751一级序列分析显示，其C端存在HEXXH金属蛋白酶基序，通过引入 3个独立突变点 （AEXXH［H198A］，HAXXH［E199A］和 HEXXA［H202A］）可阻止 Tp0751介导纤维蛋白凝块溶解作用，但该点突变不影响Tp0751与宿主成分黏附作用［2］，提示Tp0751基因的保守性在Tp体内播散中具有重要作用。

表1 实时荧光定量PCR动态检测早期兔模型不同时间皮损Tp0751和Tp0574 mRNA结果（±s）

表1 实时荧光定量PCR动态检测早期兔模型不同时间皮损Tp0751和Tp0574 mRNA结果（±s）

注：n=3。a：用SNK法对各时间点均值间两两比较，Tp0574和Tp0751转录水平与其他时间点比较，差异均有统计学意义，P＜0.05

活检时间 Tp0751拷贝/μl Tp0574拷贝/μl Tp0751×100/Tp0574第6天 1.78±2.68 17.78±23.45 3.68±5.54第9天 1.96±1.40 30.22±19.96 9.44±10.36第12天 9.57±8.07 106.83±80.65 8.16±2.91第15天 32.50±19.48a 490.33±338.64a 7.01±0.94第18天 12.28±7.21 126.78±74.29 9.85±2.02第21天 0.76±0.56 8.78±5.83 12.08±7.59第24天 2.09±1.90 6.89±2.71 29.31±20.93a第27天 11.41±17.31 44.22±59.25 13.58±13.79第30天 1.62±1.67 7.22±8.32 11.08±9.22

本研究予3只兔背部皮下注入Nichols Seattle株，每隔3天行皮肤活检术，取皮损行Tp0751和Tp0574 mRNA荧光定量PCR检测。在皮下注入Tp后第6天出现红色小丘疹。随时间的增加，丘疹逐渐增大。当到第19天时，皮疹达最大并出现溃疡。在第25天，早期兔模型出现全身播散性红色、略高于皮肤的二期梅毒疹。二期梅毒疹持续5～7 d后消失。以上实验与Godornes等［6］建立的早期梅毒模型观察到的结果相似，证明早期梅毒兔模型建立成功。分别对Tp早期兔模型皮损Tp0574和Tp0751 mRNA进行动态表达水平检测发现，二者的mRNA水平呈现逐渐上升趋势，到第15天达最高峰（P＜0.05），其后迅速下降。虽然在第27天又有少许上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）。Tp0574和Tp0751转录水平与Tp在宿主一期皮损内增殖（早期转录水平增加）和诱导宿主后天抗感染免疫所致的病原体清除（后期下降）的过程相平行，进一步支持早期梅毒模型建立成功。

Tp0751转录水平受皮损内Tp数量多少影响，为获得标准化Tp0751 mRNA水平，我们需要选用合适的参比基因作为对照，以期获得可靠的实验数据。Giacani等［8］为检测不同Tp菌株感染兔模型睾丸中tpr基因mRNA表达水平，选择多个Tp高转录表达基因如47 000的脂蛋白基因（Tp0574）、flaA 基 因 （Tp0249）、tpp17 基 因 （Tp0435）、groEL 基 因（Tp0030）和V型ATP酶的A亚基（Tp0426）进行转录水平分析。结果发现，Tp0574和Tp0426基因二者在不同Tp菌株感染峰值间的表达差异最低，因此，建议使用任一基因作为参照基因用于mRNA表达标准化的参考基因。此外，Smajs等［9］研究显示，Tp0574在Tp体内持续稳定表达，通过计算Tp0574 cDNA/DNA比值（17.7）可间接计算出皮损内Tp感染数。为此，我们选用Tp管家基因Tp0574作为Tp0751标准化的参比基因，最终获得较为客观的Tp0751转录水平动态变化趋势。

Tp自然感染过程始于黏附到暴露的黏膜表面或表皮微损伤，随后Tp开始在感染入口处繁殖并诱导产生一期梅毒皮损（硬下疳），该皮损含有大量的螺旋体。硬下疳持续存在，直到宿主后天抗感染免疫的形成，引发调理吞噬介导的病原体清除，从而使硬下疳皮损自然消退［10-11］。虽然在一期梅毒皮损形成的早期Tp就开始播散并侵入身体各处，但Turner等［12］研究证实，二期梅毒主要由Tp通过造血系统在体内的播散所致。Reid等［13］根据对TprK可变区异质性研究显示，96%的二期梅毒疹由于单个Tp的体内再次播散所致。

我们的结果显示，Tp0574和Tp0751 mRNA在接种Tp第15天后迅速下降，提示兔模型皮损内Tp被宿主局部后天抗感染免疫大量清除，从而使二者mRNA水平表达下降。而标准化的Tp0751从第15天起转录水平逐渐升高，在第24天（即出现全身播散性二期梅毒疹前1天）达最高峰（P＜0.05）。根据前期体外Tp0751的黏附和播散功能研究结果，结合以上数据，我们推测，在早期梅毒皮损形成后期，Tp为了对抗宿主后天抗感染免疫引发调理吞噬介导的清除作用，通过高度表达Tp0751蛋白降解层黏连蛋白和纤维蛋白原，进而在宿主体内播散。

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Transcript levels of theTreponema pallidumprotein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis

Ke Wujian*,Yang Huilan,Yang Bin,Zheng Heping,Yang Ligang,Chen Zhengyu,Xue Yaohua,Ren Xuqi,Lyu Ping,Zhang Xiaohui,Wang Liuyuan.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou 510009,China

ObjectiveTo trace changes in the transcript level of theTreponema pallidum（Tp）protein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis.MethodsThree New Zealand white rabbits were intracutaneously injected with 0.1 ml of Tp （Nichols Seattle strains）suspensions （107treponemes/ml）at 10 sites on the shaved back to establish a model of early syphilis.All the rabbits

a single injection with the total amount of treponemes being 107.Then,skin changes at injection sites were observed,and the size of skin rashes was recorded on a daily basis.Skin specimens sized 0.4 cm × 0.4 cm were excised from an injection site and a non-injection site（negative control）separately every 3 days for the detection of Tp0751 and Tp0574 mRNAs.The whole experiment lasted 30 days,and a total of 11 skin biopsies were carried out.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expressions of Tp0751 and Tp0574 continuously and dynamically during the development of chancre.ResultsAfter intracutaneous injection of Tp suspensions,red papules occurred on the back of rabbits on day 6,and reached maximum size on day 19 with the formation of ulcer and chancre.On day 25,disseminated secondary syphilides gradually appeared all over the body surface of the rabbits.The mRNA expression levels of Tp0574 and Tp0751 increased at the early stage,peaked onday 15（compared with the other time points,allP＜0.05）,thereafter rapidly declined,but rose slightly on day 27.The standardized expression level of Tp0751 mRNA increased gradually after day 15,and peaked on day 24（compared with the other time points,allP＜ 0.05）.ConclusionThe transcript level of Tp0751 was high in rabbits at the late stage of Tp clearance when generalized disseminated secondary syphilides had not appeared,suggesting that Tp0751 may be involved in the systemic spread of Tp.

Treponema pallidum;Syphilis;Models,animal;Rabbits;Tp0751 protein

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Yang Bin,Email:yangbin101@hotmail.com

作者单位：510009广州，广东省皮肤性病防治中心（柯吴坚、杨斌、郑和平、杨立刚、陈征宇、薛耀华、任旭琦、吕萍、张晓辉、王柳苑）；广州军区广州总医院（杨慧兰）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.011

广东省医学科研基金指令性课题（C2012032）

杨慧兰，Email：huilany88@hotmail.com；杨斌，Email：yangbin101@hotmail.com

2015-03-17）

（本文编辑：吴晓初）