慢性皮质酮注射对小鼠抑郁样行为及脑糖原水平的影响*

张绘宇， 赵玉男， 王中立

抑郁症(depression)是一种以显著而持久的心境低落为主要临床表现的情感障碍性疾病，其发病率随着人们生活水平的提高、工作生活压力的增加呈逐年上升趋势。到2020年可能成为仅次于心脏病的第2大疾患。大量的临床资料显示当机体受到长期强烈身心应激刺激时，神经内分泌活动增强，表现为下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary bodyadrenal gland，HPA)轴的功能亢进，糖皮质激素水平急剧升高。抑郁症患者皮质醇水平增高，使患者产生认知功能障碍和情感障碍［1］。在啮齿类动物，长期皮下注射皮质酮(corticosterone，CORT)可诱导出抑郁样行为［2］，神经元结构可塑性指标突触素(synaptophysin，SYP)表达下调［3］，海马 CA3 区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)降低［4］，导致神经元功能障碍［5］。这可能是长期CORT注射诱导了抑郁样行为。然而，神经元功能障碍的机制尚不清楚。

目前的研究结果表明，神经元的活动所需能量依赖于脑糖原。脑糖原是非常重要的脑能量储备。脑糖原不仅为星形胶质细胞的生存和功能提供了物质基础，还为神经元的活动和生存提供能量［6］，脑糖原是神经元活动的主要能量来源。因此脑糖原代谢异常可能是应激致海马神经元结构可塑性损伤的早期重要环节。为了进一步阐明抑郁样行为的发病机制，本研究采用慢性应激抑郁模型，从而探讨慢性皮质酮注射对脑糖原水平的影响。

材料和方法

1 实验动物、药品与试剂

健康成年雄性ICR级C57BL/6N小鼠，体重在18～20 g之间，购于扬州大学比较医学中心，许可证号为SCXK(苏)2012-0004。饲养于南京中医药大学动物实验中心，饲养温度为(25±1)℃，标准的12 h等分动物房(光照从早上6 h到下午6 h)，动物可以自由饮食进水。被用于实验和其它科学用途的脊椎动物根据中国动物保护公约制定饲养环境和实验操作规则，动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

皮质酮、淀粉葡萄糖苷酶、己糖激酶、尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸、1，6-二磷酸葡萄糖、腺嘌呤核糖核苷酸、葡萄糖磷酸变位酶、丙酮酸激酶均购自Sigma;腺嘌呤核苷三磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶购自Solarbio;乳酸脱氢酶购自 Generay;β-actin和SYP单克隆抗体、BDNF多克隆抗体购自Abcam;HRP标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG购自Gene Script;其它试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司。

2 方法

2.1 CORT注射诱导小鼠慢性应激性抑郁模型 40只C57BL/6N小鼠均为雄性，适应性喂养1周，自由进食饮水。动物随机分为2组，每组10只，称重。根据文献［2］给予小鼠皮下注射CORT，制备慢性应激性抑郁模型。模型组按20 mg·kg－1·d－1剂量给予皮下注射CORT混悬液(混悬液浓度为2 g/L)，对照组每天皮下注射相同剂量的溶剂，连续注射4周后称量体重，进行行为学测试。最后抽血检测CORT并行Western blot、糖原及其酶的含量测定实验。

2.2 小鼠强迫游泳实验 强迫游泳实验(forced swim test，FST)采用上海吉量软件科技有限公司的JLBehv-FSG-4型小鼠强迫游泳测试分析系统进行测试，将小鼠分别放入加有15 cm水深的5 000 mL的大烧杯中(水温25℃)，使小鼠强迫游泳6 min，计算机自动记录小鼠在实验后4 min内累计不动时间。不动时间被界定为没有主动逃脱行为，比如游泳、跳跃、躬起身体、探查和水下动作等。每只动物实验后更换器皿内的水以保持水的清洁，去除动物粪便及气味的干扰。

2.3 小鼠旷场实验 旷场实验(open field test，OFT)采用上海吉量软件科技有限公司的DigBehv动物行为分析系统进行测试，将小鼠分别放入一个底部为直径30 cm、高40 cm的开放场区域内的底面中心，使用摄像机进行记录随后6 min内的小鼠自主活动情况，包括运动总路程、自主活动次数。每只小鼠测试结束后对箱底进行清洁，去除动物粪便及气味的干扰。

2.4 血清CORT的测定 1%戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，采用心脏穿刺取血约0.8 mL，静止30 min后以3 000 r/min离心15 min，收集血清备用。采用定量竞争酶联免疫法测定血清CORT。在96孔板中先预涂多克隆CORT特异性抗体，分别加入标准的血清样品25 μL和25 μL生物素标记的CORT孵育2 h，冲洗后加入链霉亲和素-过氧化物酶50 μL孵育30 min，显色后采用波长450 nm的酶标仪进行读板。每个标准血清和样本均取3个复孔的平均值进行计算，样品浓度根据标准曲线测得。

2.5 Western blot实验 取海马组织100 mg加1 mL的组织裂解缓冲液，冰浴匀浆至组织完全裂解，10 000 r/min离心3 min，收集离心上清液。在95℃水浴中变性5 min。分装放置－20℃备用。制备好电泳胶后用微量加样器将样品加入各个泳道，经10%SDS-PAGE分离，湿转法将胶上的蛋白转移到PVDF膜上。将膜漂洗后浸于含5% 脱脂奶粉的25 mL PBST缓冲液中，37℃轻摇1 h以封闭膜上的非特异结合。浸入 PBST稀释的 I抗［β-actin(1∶1 000)、SYP(1∶500)、BDNF(1∶200)］4 ℃ 静置过夜。漂洗后加入HRP标记的PBST稀释的 II抗(1∶2 000)以结合I抗室温孵育1 h。采用化学发光法进行曝光、显影，将胶片上目的条带扫描进电脑，用Bandscan软件进行灰度分析，以各样本灰度值与内参照β-actin灰度值的比值作为所测样品中目的蛋白相对含量。

2.6 脑糖原测定 脑糖原检测采用Kong等［7］报道的方法，将小鼠投入液氮中处死，取出后迅速剥离大脑，于液氮中把海马组织研磨成粉后，用6%高氯酸匀浆灭活各代谢酶的活性。取适量匀浆液用2×104U/L淀粉葡萄糖苷酶10 μL室温消化16 h，使糖原彻底分解成葡萄糖。加入6%高氯酸终止反应离心取上清，用3 mol/L KOH溶液调节pH值，使pH=7。在96孔加样板中加入200 μL的反应体系，以355 nm激发、480 nm发射、420 nm的截止波长，采用萤光酶法测定葡萄糖的含量。加入0.3 U己糖激酶50 μL读取总数值。同时，按上述操作不加淀粉葡萄糖苷酶，测出组织中所含的内源性葡糖糖量，用总葡萄糖含量减去内源性葡萄糖的含量，即为糖原分解所得到的葡萄糖。基于这个数值，从糖原含量测定标准曲线上即可计算得出组织中糖原的含量。

2.7 糖原合酶检测 在海马组织中加入预冷匀浆液5 mL/g，在冰上彻底匀浆备用。在20 μL样品中加入尿苷二磷酸葡萄糖反应液50 μL，38℃水浴60 min。取出后加入10 μL反应终止液，室温下放置30 min。加入l mL尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸反应液室温放置20 min后，以激发光340 nm、发射光460 nm测定荧光吸光值。同时，按上述操作不加2 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖和5 mmol/L 6-磷酸葡萄糖测出组织空白值，再用总糖原合酶荧光值减去组织空白荧光值，最终在尿苷二磷酸标准曲线中查出对应值。

2.8 糖原磷酸化酶检测 在180 μL30℃和pH=6.8的磷酸盐缓冲液中加入20 μL样本匀浆液。加入2 g/L的糖原开始反应。糖原被糖原磷酸化酶分解产生葡萄糖-1-磷酸，再经磷酸葡萄糖变位酶作用生成葡萄糖-6-磷酸，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应体系中，我们可通过测定 NADP(低吸收峰)转化为NADPH(高吸收峰)，即在340 nm波长处所产生的吸光值的变化，来定量分析糖原磷酸化酶的特异活性。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均值±标准差(mean±SD)表示，各组间数据差异用t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 体重及行为学检测结果

小鼠皮下注射CORT，4周后模型组的体重显著低于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。在强迫游泳实验中表现出不动时间显著延长，出现抑郁样行为特征。模型组小鼠强迫游泳的静止时间较正常组明显延长(P＜0.01)。在旷场实验中表现动物的自发活动明显减少，出现抑郁样行为特征。模型组小鼠运动的总路程减少、活动次数明显下降(P＜0.01)，见表 1。

表1 模型组与正常组小鼠体重及行为学检测结果Table 1.The weight and behavior of mice in control and CORT group(Mean±SD.n=20)

2 皮质酮检测结果

实验进行4周后，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清的CORT水平显著升高(P＜0.01)，见图1。

Figure 1.Serum corticosterone levels in control and CORT-injected mice.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.图1 正常组与模型组血清皮质酮浓度的比较

3 神经元标志性蛋白含量的变化

模型组的SYP和BDNF蛋白条带密度显著下降，与正常组相比，模型组小鼠海马组织内的2种蛋白表达均明显下调(P＜0.01)，见图2。

4 脑糖原及其相关酶含量的变化

小鼠皮下注射CORT 4周后，型组与正常对照组相比，脑糖原和脑糖原合酶含量明显降低(P＜0.05)。但模型组脑糖原磷酸化酶含量高于正常对照组(P ＜0.05)，见图3。

讨 论

Figure 2.The effects of CORT injection on the protein levels of SYP and BDNF in the mouse hippocampal tissues.Mean±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.图2 CORT注射对小鼠海马组织内SYP和BDNF蛋白表达的影响

Figure 3.The effects of CORT injection on the levels of brain glycogen，glycogen synthase and glycogen phosphorylase in the mouse hippocampal tissues.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs control.图3 CORT注射对小鼠海马组织糖原、糖原合酶和糖原磷酸化酶含量的影响

本实验根据前期研究成果［2］连续4周小鼠皮下注射CORT后，采用计算机图像实时分析检测系统，动态分析动物的活动轨迹。慢性应激组小鼠食欲减退，体重降低。在强迫游泳和旷场2个行为学实验中，小鼠静止不动的时间明显延长，小鼠自主活动能力降低，反映小鼠的自主活动能力降低、情绪低落、兴趣丧失、绝望状态、认知和记忆能力减退，与抑郁症患者出现的情绪低落和易疲劳等症状相似。以上结果证明慢性皮质酮注射成功诱导小鼠抑郁样行为。在啮齿类动物重复注射CORT已经被认为是一个可靠的研究慢性应激性抑郁障碍的动物模型［8］。

Figure 4.A model for energy substrate supply pathways of the neuron.图4 神经元的能量底物供给途径模型

SPY是位于突触前膜囊泡上与突触结构和功能密切相关的钙结合膜蛋白，参与突触小泡膜与突触前膜的融合和神经递质的释放，还参与了神经元间信息传递。因此突触素既是突触发生的标志，又是突触传递效能的反映，其定量和定性分布可以准确反映突触的分布与密度［9］。Yau 等［10］发现，皮质酮可以抑制神经系统的形成，从而降低海马树突棘密度而引起空间学习障碍。本研究的数据表明，长期注射CORT，神经系统突触发生和成熟标志性蛋白SYP的水平均明显下降。提示CORT升高影响突触的形成与成熟，突触数目的减少与功能降低将影响神经系统的信息传递。

星形胶质细胞合成和释放多种神经营养因子，对神经元功能的维持至关重要，而其中最多的是BDNF。BDNF基因位于11q13，主要促进海马齿状回神经干细胞生长、分化，维持神经元生存，参与调控海马神经重塑，拮抗神经元受损，并与长时程学习、记忆功能有关［11］。临床尸检研究发现抑郁症患者脑组织中BDNF水平显著降低，抗抑郁剂治疗后患者抑郁症状缓解，血清BDNF水平可恢复正常［12］，且经过抗抑郁治疗的患者脑组织中BDNF也恢复正常。BDNF下调可能降低神经元可塑性而促进神经元死亡。有研究表明［13］，长期注射皮质酮或慢性应激能降低大鼠海马BDNF表达，并且海马区和前额区BDNF的mRNA水平下降，从而影响海马结构可塑性，诱导了抑郁样行为，并且敲除动物齿状回BDNF基因使其抑郁样行为增加。Yu等［14］的研究表明，BDNF已被证明能够调节神经元的形态，慢性应激降低脑组织BDNF水平，使神经树突棘密度降低从而诱导了抑郁样行为。近年来，动物模型和临床研究均提示，海马脑源性神经营养因子BDNF缺乏可能与抑郁发生密切相关。我们的研究验证了这一结论，长期注射CORT损伤海马神经元结构，下调小鼠海马的BDNF表达，小鼠出现抑郁样行为。

糖原由葡萄糖单位组成的具有高度分支结构的大分子多糖，是人和动物体内主要的葡萄糖储存形式。当机体需能增加而葡萄糖减少时，糖原可以迅速分解为葡萄糖或生成乳酸，为机体提供能量。脑糖原是非常重要的脑能量储备，几乎全部储存在星形胶质细胞中［15］，是神经元活动的主要能量来源。脑糖原不均匀地分布在整个大脑，电子显微镜的研究表明，脑糖原集中的区域也是突触密度最高的脑区，也许这意味着在突触传递的能量依赖性［16］。由于神经元对能量危机非常敏感，而神经元的能量储存又很有限，因此，糖原能量是正常神经元的功能和生存的关键。神经元的神经能量底物有2个主要来源，一是血液循环中的葡萄糖直接供给，葡萄糖进入神经元后发生氧化代谢。除了葡萄糖直接进入神经元外，第2个来源是葡萄糖首先进入星形胶质细胞，并以糖原的形式储存起来，当神经元活动增加需要能量时，糖原可迅速分解代谢成乳酸，作为能量底物转运给神经元［17］(图4)。神经元的活性依赖于乳酸，为高效能的突触传递提供能量需求。研究表明［18］在海马星形胶质细胞中糖原源性乳酸也是神经元空间工作记忆的重要物质基础。因此，当神经元需求能量增加时，星形胶质细胞存储的糖原提供了一个充足的能量储备。

因为脑糖原是中枢神经系统中最大的能源储备，星形胶质细胞的糖原含量的变化可能会显著影响大脑的能量代谢。糖原水平的减少会直接影响星形胶质细胞的代谢和功能。星形胶质细胞对神经元起到重要的营养作用。因此，星形胶质细胞本身的变化也会直接影响神经元的代谢和功能。如果星形胶质细胞不能及时为大脑提供糖原能量，将导致神经元细胞的萎缩和死亡。一旦中枢神经系统中的糖原含量减少，神经递质和动作电位也会立即受到严重影响。因此，脑糖原的缺乏可以直接影响星形胶质细胞的结构和功能，导致星形胶质细胞萎缩，从而又会进一步加重神经元的能源危机，增加细胞凋亡的风险，减少神经元的兴奋性，诱导抑郁样行为。糖皮质激素可以直接影响星形胶质细胞的糖原代谢，糖皮质激素显著降低的时候，可促进糖原合成。体外培养大鼠海马星形胶质细胞的研究表明，皮质酮可以显著降低星形胶质细胞内糖原含量［19］。在以往的研究中发现，束缚应激导致小鼠糖代谢紊乱，糖原含量降低［20］。我们的研究表明，与对照组相比小鼠长期注射CORT，海马糖原含量显著降低，从而降低了神经元的兴奋性，诱导了小鼠的抑郁样行为。

动物实验和组织细胞培养表明，糖原受多因素影响，包括葡萄糖、胰岛素、神经递质以及神经元的激活等。脑糖原合成与降解受2个关键酶的调节，分别为糖原合酶和糖原磷酸化酶。葡萄糖合成糖原取决于糖原合酶和糖原分支酶的活性;降解发生在细胞质中，通过糖原磷酸化酶和分支酶的作用。在我们的研究中，我们发现慢性注射皮质酮增加糖原磷酸化酶的活性，表明增加糖原分解。并且慢性注射皮质酮降低糖原合酶活性，使糖原合成减少，结果使糖原含量下降。糖皮质激素可抑制葡萄糖转运到神经元和星形胶质细胞，减少糖原合成。因此，慢性应激可能是通过增加下丘脑-垂体-肾上腺活动的情况下调星形胶质细胞的糖原储存。海马糖原水平的降低是因为糖原合酶的减少以及糖原磷酸化酶的增加。高浓度的糖皮质激素作用于星形胶质细胞会损害糖原的补充，消耗的能量储备，减少乳酸运输，减少能量的供给，这将引起神经元的功能障碍，从而引起抑郁样行为。

［1］ Zhao Y，Wang Z，Dai J，et al.Beneficial effects of benzodiazepine diazepam on chronic stress-induced impairment of hippocampal structural plasticity and depressionlike behavior in mice［J］.Behav Brain Res，2012，228(2):339-350.

［2］ Zhao Y，Ma R，Shen J，et al.A mouse model of depression induced by repeated corticosterone injections［J］.Eur J Pharmacol，2008，581(1-2):113-120.

［3］ Zhao Y，Xie W，Dai J，et al.The varying effects of shortterm and long-term corticosterone injections on depressionlike behavior in mice［J］.Brain Res，2009，1261:82-90.

［4］ Numakawa T，Adachi N，Richards M，et al.Brain-derived neurotrophic factor and glucocorticoids:reciprocal influence on the central nervous system［J］.Neuroscience，2013，239:157-172.

［5］ Duric V，Banasr M，Stockmeier CA，et al.Altered expression of synapse and glutamate related genes in postmortem hippocampus of depressed subjects［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2013，16(1):69-82.

［6］ Sickmann HM，Waagepetersen HS，Schousboe A，et al.Brain glycogen and its role in supporting glutamate and GABA homeostasis in a type 2 diabetes rat model［J］.Neurochem Int，2012，60(3):267-275.

［7］ Kong J，Shepel PN，Holden CP，et al.Brain glycogen decreases with increased periods of wakefulness:implications for homeostatic drive to sleep［J］.J Neurosci，2002，22(13):5581-5587.

［8］ Marks W，Fournier NM，Kalynchuk LE.Repeated exposure to corticosterone increases depression-like behavior in two different versions of the forced swim test without altering nonspecific locomotor activity or muscle strength［J］.Physiol Behav，2009，98(1-2):67-72.

［9］ Brachya G，Yanay C，Linial M.Synaptic proteins as multi-sensor devices of neurotransmission［J］.BMC Neuroscience，2006，7(Suppl 1):S4

［10］Yau SY，Lau BW，Tong JB，et al.Hippocampal neurogenesis and dendritic plasticity support running-improved spatial learning and depression-like behaviour in stressed rats［J］.PLoS One，2011，6(9):e24263.

［11］于 琦，金光亮.三种复方对慢性应激模型大鼠海马CREB、BDNF基因表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2009，25(3):591-594.

［12］ Karege F，Bondolfi G，Gervasoni N，et al.Low brain-derived neurotrophic factor(BDNF)levels in serum of depressed patients probably results from lowered platelet BDNF release unrelated to platelet reactivity［J］.Biol Psychiatry，2005，57(9):1068-1072.

［13］ Yulug B，Ozan E，Gonul AS，et al.Brain-derived neurotrophic factor，stress and depression:an review［J］.Brain Res Bull，2009，78(6):267-269.

［14］Yu H，Wang DD，Wang Y，et al.Variant brain-derived neurotrophic factor val66met polymorphism alters vulnerability to stress and response to antidepressants［J］.J Neurosci，2012，32(12):4092-4101.

［15］ Pfeiffer-Guglielmi B，Fleckenstein B，Jung G，et al.Immunocytochemical localization of glycogen phosphorylase isozymes in rat nervous tissues by using isozyme-specific antibodies［J］.J Neurochem，2003，85(1):73-81.

［16］ Xu L，Sun H.Pharmacological Manipulation of brain glycogenolysis as a therapeutic approach to cerebral ischemia［J］.Mini Rev Med Chem，2010，10(12):1188-1193.

［17］ Suzuki A，Stern SA，Bozdagi O，et al.Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation［J］.Cell，2011，144(5):810-823.

［18］ Newman LA，Korol DL，Gold PE.Lactate produced by glycogenolysis in astrocytes regulates memory processing［J］.PLoS One，2011，6(12):e28427.

［19］ Allaman I，Pellerin L，Magistretti PJ.Glucocorticoids modulate neurotransmitter-induced glycogen metabolism in cultured cortical astrocytes［J］.J Neurochem，2004，88(4):900-908.

［20］ Tsoi B，He RR，Yang DH，et al.Carnosine ameliorates stress-induced glucose metabolism disorder in restrained mice［J］.Pharmacol Sci，2011，117(4):223-229.