大内径多壁碳纳米管基靶向缓释载药系统的制备及性能

孟艾，杨涛，王娉婷，王剑，隋磊△

大内径多壁碳纳米管基靶向缓释载药系统的制备及性能

孟艾1，杨涛1，王娉婷1，王剑2，隋磊1△

目的制备大内径多壁碳纳米管（LID-MWCNT）基靶向抗肿瘤药物缓释系统，分析其功能特性并检测其对肿瘤细胞的增殖抑制作用。方法纯化、切割LID-MWCNT，制备碳管载体及同源封堵物超短LID-MWCNT（UST）。碳管表面负载靶向分子叶酸（FA）及荧光标记分子；管内负载抗肿瘤药物顺铂（CDDP），并以UST封堵药物通道。观察载药系统显微形态；测定载药率及药物释放曲线；观察载药系统对肿瘤细胞的靶向趋化状况及增殖抑制效应。结果成功制备大内径多壁碳纳米管基靶向抗肿瘤药物缓释系统（CDDP@UST-FA-LID-MWCNT），其载药率为70.97%。体外释放呈双相缓释模式，持续释放时间约18 h。载体系统具备了一定靶向趋化能力；较低载药浓度的CDDP@UST-FA-LID-MWCNT即对肿瘤细胞具有增殖抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用增强。结论载药系统CDDP@UST-FA-LID-MWCNT具有较高的载药率及良好的药物缓释效果，能够靶向作用于肿瘤细胞，具有较强的抗肿瘤作用。

纳米管，碳；顺铂；抗肿瘤药；药物载体；迟效制剂；多壁碳纳米管；靶向作用；释放模式

近年来，功能化碳纳米管（CNT）载药研究成为生物医学领域的新兴热点［1］。CNT载药方式分为管外载药和管内载药，管内载药相较管外载药具有以下优势：避免光敏感性药物暴露在CNT载体表面可能发生的运载过程中失活；易于实现缓释或控释；避免药物与管壁功能修饰基团竞争位点，从而确保改性效果［2-3］。然而，由于常规CNT内径较小，造成管内载药量较低［4-5］，成为管内载药研究的瓶颈。大内径多壁碳纳米管（LID-MWCNT）为解决上述问题提供了可能。其内径为常规CNT的2～3倍，管内可以容纳更多生物分子。本研究旨在利用LID-MWCNT管内负载抗肿瘤药物和超短LID-MWCNT（UST）封堵药物释放通道，同时管外负载叶酸（FA）作为靶向分子，以期获得高载药率并具有靶向缓释性能的抗肿瘤载药系统。

1 材料与方法

1.1 材料LID-MWCNT（中国科学院成都有机化学有限公司），FA、异硫氰酸荧光素（FITC）、顺铂（CDDP）购自Sigma公司，人颌面部舌鳞癌细胞株（CAL-27）及人乳腺癌细胞株（MCF-7）均由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。扫描电镜（SEM，Inspect F50，FEI，美国），紫外可见光光度计（UV-VIS，HTS 7000 Plus，PerkinElmer，美国），透射电子显微镜（HR-TEM，Tecnai G2 F20，FEI，美国），电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES；Spark公司，德国），酶标仪（HTS 7000 Plus，PerkinElmer，美国），倒置荧光显微镜（Olympus IX 710 microscope，日本）。

1.2 LID-MWCNT纯化氧化及UST制备以本课题组前述方法［6］制备高纯度氧化LID-MWCNT。使用0.1 μm孔径的聚四氟乙烯（PTFE）膜过滤LID-MWCNT悬浮液：滤液于150℃空气煅烧1 h获得UST；沉淀洗涤至中性后用0.2 μm及0.1 μm孔径的PTFE膜过滤，得到长度为100～200 nm的LIDMWCNT。150℃下煅烧30 min获得氧化LID-MWCNT（OLID-MWCNT）。采用SEM观察处理前后碳管的表面形貌和分散情况。

1.3 功能化LID-MWCNT的制备分别称取20 mg O-LIDMWCNT与20 mg磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基（PEG）置于超纯水中超声2 h，过滤洗去未反应PEG。收集沉淀并重悬得到PEG-LID-MWCNT悬液。取20 mg FA溶于DMSO中，加入PEG-LID-MWCNT悬液，避光超声2 h，洗涤重悬得到FA-LIDMWCNT悬液。用相同方法接枝荧光标记分子异硫氰酸荧光素（FITC），得到FA-LID-MWCNT-FITC悬液。采用紫外可见分光光度法观察碳管接枝FA前后吸收光谱变化。

1.4 药物负载及通道封堵称取20 mg CDDP及10 mL DMSO加入到10 mL 1 g/L FA-LID-MWCNT悬液中，室温下避光搅拌72 h。过滤洗涤，重悬沉淀得到CDDP@FA-LIDMWCNT悬液。4 mg UST加入到CDDP@FA-LID-MWCNT悬液中（含4 mg LID-MWCNT），暗室搅拌24 h。过滤洗去未反应的US-O-LID-MWCNT，重悬沉淀得到CDDP@USTFA-LID-MWCNT悬液。采用HR-TEM及SEM，观察载药后及封堵后载药系统的显微形貌。分别取2 mL CDDP@FALID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT悬液，ICPOES测定Pt含量。将Pt质量换算为CDDP质量后计算CDDP载药率：载药率=CDDP质量/LID-MWCNT质量×100%。

1.5 CDDP体外释放实验使用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和醋酸缓冲液（pH 5.5）体外模拟中性以及酸性体液环境。分别取2 mL CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LIDMWCNT悬液装入截留相对分子质量为1 000的透析袋内，置于198 mL缓冲液中，于37℃水平恒温振荡器内进行动态透析；分别于0.25、0.5、1、3、6、12、24、48、72 h后取出缓冲液2 mL，同时补充2 mL新鲜缓冲液。ICP-OES测定不同时间点悬液中Pt的含量，获得CDDP在中性和酸性条件下的体外释放曲线。

1.6 载药系统靶向性测定取对数生长期的CAL-27及MCF-7细胞，分别接种于6孔板中，孵育24 h，加入1 mL CDDP@UST-FA-LID-MWCNT-FITC及CDDP@UST-LIDMWCNT-FITC悬液，继续培养2 h，以4%多聚甲醛固定15 min，1.2µmol/L DAPI染色5 min，洗去游离染料后于倒置荧光显微镜下观察2组载药系统细胞内外的分布情况。

1.7 载药系统的细胞毒性实验采用CCK-8法检测空载体及不同CDDP浓度载药系统对细胞增殖的影响。将细胞接种于96孔板中，分为4组，每组5个复孔。FA-LID-MWCNT组分别加入质量浓度为2.5、5、10、20、40和80 mg/L的FALID-MWCNT悬液。其他3组分别加入2.5、5、10、20、40和80 mg/L CDDP等效浓度的CDDP、CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT悬液，共培养24 h后加入10 μL CCK-8溶液，低速振荡10 min，继续孵育2 h后常规检测各孔光密度（OD）值并计算细胞存活率。

1.8 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件分析，采用方差分析进行组间比较，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 功能化LID-MWCNT表征SEM观察结果显示，未处理的LID-MWCNT碳管弯曲，分散性差，长度为5～10 μm；管壁表面存在大量无定形碳、金属颗粒等杂质粒子，见图1a。经氧化处理后，碳管管间团聚程度减弱，碳管长度减小；管壁出现大量孔洞，表面杂质被去除。所得O-LID-MWCNT经滤膜筛选后长度为100～200 nm者被用于管内负载药物，见图1b。而长度小于100 nm者被用于封堵药物释放通道，见图1c。紫外-可见吸收光谱结果表明通过酰胺化反应，FA成功接枝到管壁表面，见图2。

Fig.2UV-Vis spectra of PEG-LID-MWCNT，FA，and FA-LID-MWCNT图2 PEG-LID-MWCNT、FA、FA-LID-MWCNT紫外-可见吸收光谱

2.2 载药体系观察及载药率计算HR-TEM结果显示载药反应后O-LID-MWCNT载体管内存在平均直径为1～2 nm的黑色圆点，见图3a，并由能量色散X射线检测证实其为CDDP，见图3b。SEM观察显示US-O-LID-MWCNT与载药系统反应后结合在载体管外壁表面及末端开口处，实现了对药物进出通道的封堵，见图3c。而随时间的延长，US-OLID-MWCNT封堵物逐渐与载体脱离，管内药物进而得到释放，见图3d。计算得CDDP@UST-FALID-MWCNT的载药率为70.97%；而未封堵的CDDP@FA-LID-MWCNT载药率为84.28%。

2.3 体外释放模式未以US-O-LID-MWCNT封堵的CDDP@FA-LID-MWCNT呈单相释放模式，在最初3 h内释放率达81%～82%，而在之后的69 h内释放量仅约10%；CDDP@UST-FA-LID-MWCNT呈双相释放模式，在最初3 h内药物释放57%～58%，随后15 h内缓慢释放约22%～24%，之后54 h内释放极少；释放曲线受pH影响不明显，见图4。

Fig.4The CDDP release profile of drug delivery system under different pH图4 封堵及未封堵载药系统在不同pH环境中的CDDP释放曲线

2.4 载药系统的靶向性观察CDDP@UST-FALID-MWCNT-FITC及CDDP@UST-LID-MWCNTFITC分别作用于CAL-27和MCF-7细胞后的分布见图5。大部分CDDP@UST-FA-LID-MWCNTFITC位于细胞质内，且其细胞摄入量明显高于未接枝FA的CDDP@UST-LID-MWCNT-FITC。

2.5 载药系统对肿瘤细胞增殖的影响CCK-8结果显示不同浓度FA-LID-MWCNT悬液分别作用于细胞CAL-27和MCF-7 24 h后，细胞存活率均在90%以上。游离CDDP、CDDP@FA-LID-MWCNT和CDDP@UST-FA-LID-MWCNT分别作用于细胞CAL-27和MCF-7 24 h后，细胞的存活率随管内CDDP浓度增加而降低。在CDDP等效质量浓度为10、20、40 mg/L时，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT对CAL-27细胞的细胞毒性显著高于其他实验组（P＜0.05）；在CDDP等效质量浓度为10、20 mg/L时，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT对MCF-7细胞的细胞毒性显著高于其他实验组（P＜0.05），见图6。

Fig.6The viability of CAL-27 cells（a）and MCF-7 cells（b）with different concentration of FA-LID-MWCNT，CDDP@UST-FA-LIDMWCNT，CDDP@FA-LID-MWCNT，and CDDP图6 经不同浓度FA-LID-MWCNT、CDDP@UST-FA-LIDMWCNT、CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP处理后CAL-27（a）细胞及MCF-7（b）细胞的存活率

3 讨论

LID-MWCNT的发现为解决CNT管内载药空间有限的问题提供了新的可能。本课题组已建立了有效纯化LID-MWCNT并同时完成碳管氧化切割的方法，获得了具有良好分散性的O-LID-MWCNT，其末端开口及侧壁孔洞将成为理想的药物进出碳管的通道；而通道周围的含氧基团则为LID-MWCNT的功能化修饰奠定了基础。

本研究中，通过滤膜筛选长度为100～200 nm的纯化LID-MWCNT作为CDDP载体，其原因在于这一长度范围的LID-MWCNT既具有较好的分散性，又能够保证较高的管内药物负载量，同时由于其长度小于常规无菌膜孔径尺寸，利于后续进行除菌操作。

为避免CDDP突释可能造成的中性粒细胞减少、肾小管损伤、神经毒性等不良反应［7］，在将CDDP载入管腔内后需要对药物通道进行有效封堵，进而实现药物缓释。由于LID-MWCNT末端开口及侧壁孔洞的直径较大，常规的CNT封堵物如液相C60［8］、聚吡咯膜和烷硫醇功能化纳米金颗粒［9-10］等均因尺寸太小而无法完成封堵。本实验中发现，在O-LIDMWCNT中，长度小于100 nm的UST呈球状结构，其直径接近O-LID-MWCNT的末端开口及侧壁孔洞的尺寸，同时其与载体碳管为同源产物，生物相容性可靠，可以作为封堵物应用。UST可有效封堵药物通道。封堵后CDDP释放呈缓释模式，释放时间约为封堵前的6倍。载药系统在不同pH环境下表现出相似的释放曲线，表明UST与载体碳管间的吸附作用无pH敏感性，可能源于范德华力作用。

本实验所得CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT的载药率显著高于以往报道的CNT基载药系统［11-12］，表明其能够以较低载体浓度来获得CDDP的有效临床剂量，有利于最大程度降低不良反应及纳米颗粒累积的风险。由于封堵后需要进行洗涤处理以去除未反应的UST，管内一部分CDDP在此过程中释放，因此封堵后载药系统的载药率略低于封堵前。

性能优异的抗肿瘤载药系统除须具有较高的载药率及合理的药物释放模式外，还应具有肿瘤细胞靶向性。本研究通过PEG的氨基与FA的羧基发生酰胺反应，在碳管表面接枝FA，即旨在利用其受体在肿瘤细胞表面高表达的特点［13］，使载体系统具有一定的肿瘤靶向性。从荧光显微镜观察结果可以看出，相同作用时间内，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT处理组肿瘤细胞内部荧光显著强于CDDP@USTLID-MWCNT处理组，虽然单纯应用LID-MWCNT载体也可以将CDDP转运至肿瘤细胞内，但接枝靶向分子FA后的载药系统通过受体介导的内吞效应能够获得更高的转运效率［14］，且该效应具有肿瘤细胞特异性，因此可以提高药物的利用率并减少对正常细胞的损伤。

体外细胞毒性实验表明，LID-MWCNT基载体具有良好的生物相容性，而各载药实验组对于鳞癌细胞CAL-27及腺癌细胞MCF-7均有抑制作用，且在相同CDDP浓度下CDDP@UST-FA-LID-MW⁃CNT较CDDP以及未封堵载药体系具有更强的抑制作用。

（图1、3、5见插页）

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（2014-10-15收稿2015-03-01修回）

（本文编辑魏杰）

Preparation and performance of LID-MWCNT based sustained release targeted drug delivery system

MENG Ai1，YANG Tao1，WANG Pingting1，WANG Jian2，SUI Lei1△
1 Department of Prosthodontics，Hospital of Stomatology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Prosthodontics，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University△

ObjectiveTo prepare a targeted antitumor drug delivery system using large-inner-diameter multi-walled carbon nanotubes（LID-MWCNTs）for sustained release and to study its performance.MethodsLID-MWCNTs were puri⁃fied and oxidized，then use nanocarriers and USTs as homologous blockers.Folic acid and fluorescent labels were conjugat⁃ed onto the external surfaces of nanocarriers.CDDP（cisplatin）was encapsulated and ultrashort tubes（USTs）were employed to block the drug entry/exit paths.The microstructure of resulted drug delivery system（DDS）was observed，while drug load⁃ing efficiency and drug release profile in vitro were determined.The tumor-targeting property and cytotoxicity of DDS were also assessed.ResultsLID-MWCNT based sustained release targeted drug delivery system was established.Drug loading efficiency of CDDP@UST-FA-LID-MWCNTs was as high as 70.97%.A typical biphasic sustained release pattern was dem⁃onstrated，and the accumulating release time was 18 h.DDS exhibited a certain kind of tumor-targeting property，and inhibit⁃ed proliferation of tumor cells in a dose-dependent manner.ConclusionCDDP@UST-FA-LID-MWCNT drug delivery system exhibited an improved drug loading efficiency and a sustained drug release profile.It could specifically target the tu⁃mor cells and had a significant antitumor effect.

nanotubes，carbon；cisplatin；antineoplastic agents；drug carriers；delayed-action preparations；multiwalled carbon nanotubes；targeting property；release profile

R318.08

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.006

天津市应用基础及前沿技术研究计划项目（11JCYBJC10100）；四川省科技支撑计划项目（2014SZ0201）；教育部留学回国科研启动基金（2013-693-11-8）

1天津医科大学口腔医院（邮编300070）；2四川大学华西口腔医院

孟艾（1989），女，硕士，主要从事材料方面研究

△通讯作者E-mail：suilei@tmu.edu.cn