人退变腰椎间盘特异性表达microRNA的靶基因及JNK信号转导通路在椎间盘退变中的分子生物学机制

王明远 宋西正 李国栋 (青海省人民医院，青海 西宁 810001)

腰椎间盘退变(IVDD)为腰背疼痛的主要原因之一，多数研究者认为营养、遗传、力学、免疫等多种因素共同作用导致该病的发生〔1〕。其中力学因素的作用最为直接，主要由于人类的直立行走。同时在行走过程中，椎间盘易受到损伤，当髓核物质暴露于体液环境中，会激活机体中自身免疫反应和炎性因子，将退变信号传至细胞核，影响核内基因表达，影响椎间盘中关键组分的合成和降解〔2〕。因此，研究者希望通过对信号传导通路进行有效干预来减缓IVDD的病情发展〔3〕。但目前对于IVDD相关基因和调控退变信号传导的通路仍未明确，严重影响到IVDD的细胞生物学治疗进展。本研究通过筛选退变腰椎间盘中的特异性表达microRNA的靶基因，旨在探讨JNK信号传导通路在IVDD中的分子生物学机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取腰椎退行性疾病患者10例为研究组，术中均切除退变髓核组织块。排除合并肿瘤、类风湿关节炎、感染性疾病者;近3个月内接受免疫制剂治疗者;其中男7例，女3例，年龄58～71岁，L4～5间盘4例、L5～S1间盘6例，突出型5例、疝出型5例;其中5例用于筛选实验，5例用于验证实验。选取腰椎爆裂性骨折接受前路减压髓核切除术患者4例为对照组，术中均切除正常髓核组织块。腰椎间盘影像学检查均未显示出退变改变，年龄均＜25岁;其中男3例，女1例，年龄18～24岁，均为L1～2间盘组织;其中2例用于筛选实验，2例用于验证实验。

1.2 仪器与试剂 荧光定量PCR检测仪(瑞士罗氏公司，LightCycler 480型);双光子荧光显微镜(德国Lavision Biotec公司);倒置显微镜(日本尼康公司，TE2000-U型);全自动酶标仪(瑞士 TECAN公司，GENIOS M200型);CO2培养箱(美国SHEL LAB公司，2406型)。DMEM培养基(上海卡迈舒科技实业有限公司);胎牛血清(潍坊瑞华生物科技有限公司);EDTA、胰蛋白酶(美国Sigma公司);Trizol试剂(上海科敏生物科技有限公司);RNA保存液(上海逍鹏生物科技有限公司);microRNA qPCR引物、试剂盒(美国Signosis公司)。

1.3 microRNA筛选方法

1.3.1 髓核细胞分离、培养、鉴定 分别采用含青霉素和无青霉素的D-Hanks溶液将髓核组织各冲洗3遍;将髓核组织用剪刀剪碎后使用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型胶原酶在37℃条件下联合消化1 h，每5 min轻摇1次，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液。使用DMEM培养液将细胞吹匀，再次离心，重复3次。细胞计数后按1×106接种在培养瓶中，加入10 ml含青霉素100 U/ml、10%胎牛血清的DMEM培养液中。放入5%的CO2、37℃的细胞培养箱中，每2～3 d换1次培养液，并进行传代。当第1代细胞爬片到80%融合时，取出并进行瑞氏染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色等，置于关镜下对细胞进行观察。

1.3.2 数据校正及差异探针筛选 先预处理使用microRNA微阵列芯片方法获得的筛选结果，将实验中存在的随机误差对数据分析带来的影响消除;校正后的信号值采用稳定多列阵分析(RMA)归一化法获得。

1.3.3 统计学方法 采用聚类分析软件Cluster3.0以及RAM对差异表达的基因进行筛选。计算得到两样本间校正之后的荧光强度比值;将2作为阈值筛选差异microRNA，其中比值＜0.5为下调microRNA，＞2为上调microRNA。

1.4 显著性高表达microRNA的验证方法 将进行验证实验的7例标本处理后进行标记，其中对照组2例正常标本标记为1～2号，研究组5例标本标记为3～7号。将标记好的样本放于4℃冰箱中保存过夜，之后取出2 000 r/min离心10 min，弃去保存液后置于－80℃冰箱中保存。依次进行总RNA提取和microRNA反转录反应，采用无菌蒸馏水将得到的反转录产物稀释5倍后进行下游实时qPCR实验。采用染料法进行相对定量PCR分析，重复进行3次，结果取平均值。

2 结果

2.1 髓核细胞鉴定 瑞氏染色后显示细胞核呈蓝色，细胞质呈淡紫色，形态良好且边缘清晰;甲苯胺蓝染色后显示细胞核呈阳性，细胞质淡染，提示能够合成糖胺多糖;番红O染色显示细胞核较小，细胞质淡染，分散分布;Ⅱ型胶原免疫组化染色显示细胞呈棕色，细胞核呈蓝紫色，见图1。

图1 髓核细胞鉴定(×200)

2.2 差异性表达的microRNA 微阵列的基因表达数据分析与筛选显示，研究组和对照组比值＞2的上调microRNA共包含20种，其中microRNA.494和microRNA.513a.5p表现为明显高表达，比值分别为2.835 1、2.115 7。

2.3 聚类分析和靶基因预测 对差异性表达的microRNA行聚类分析，结果显示，microRNA.494和microRNA.513a.5p在1号对照组中表达水平较低，在3号和4号研究组中表达水平较高，在2号研究组中表达水平中等。采用Targetscan6.2软件进行靶基因预测显示，人退变髓核细胞中microRNA.494和microRNA.513a.5p均为高表达，预测靶基因分别为MKK4、JunD。

2.4 靶基因GO和信号传导通路分析 将差异性表达的靶基因进行GO分析显示，研究组相比于对照组上调的靶基因在相关生物学过程中有9个最明显的GO term富集度;对差异基因、靶基因进行信号传导通路分析显示，MKK4和JunD均参与了JNK信号通路，且分别处于JNK信号通路的上游和下游。

2.5 microRNA.494和microRNA.513a.5p验证和表达量 不同样品中的PCR扩增和溶解曲线microRNA.494和microRNA.513a.5p均显示为单峰，且产物具有特异性，无产物二聚体生成。将对照组中1号正常标本为对照检测Ct值，并采用2-△△Ct法计算差异倍数，其中对照组中两例标本之间差异无明显变化，2-△△Ct分别为0.89、3.24。研究组5例标本与对照组中标本1相比差异均表现为高倍数表达，2-△△Ct均值在 microRNA.494中为 12.445 0±8.042 0，在 microRNA.513a.5p中为48.477 0±37.163 6。

3 讨论

microRNA通过DNA转录形成，但无法翻译为蛋白质，在蛋白质合成过程中对其他基因的功能进行调节〔4〕。因此，在其他蛋白质编码基因的产生方面microRNA具有重要的调控作用。当炎性因子经细胞膜上的受体将细胞中的信号传导通道激活后，使细胞核中的基因表达情况发生改变，加速了椎间盘中的蛋白多糖及胶原等重要成分的降解，同时抑制了以上成分的合成，进而导致椎间盘中的水分丧失〔5〕。因此，基因治疗需要在明确介导细胞中基因表达变化的信号传导通路的基础上才能取得理想的效果。

本研究提示，JNK信号通路在腰椎间盘退变的病情进展中起到关键作用，且受到microRNA.494和microRNA.513a.5p的调控。相关研究也显示，以上两种microRNA在人体细胞的老化过程中有着明显的调节作用〔6〕。

JNK信号传导途径在细胞的应激反应过程中发挥关键作用，且能够被多种细胞外应激信号激活。除应激反应之外，该信号通路还能被白细胞介素(IL)-1、生长因子激活〔7〕。JNK蛋白激酶中存在3个编码基因，分别为JNK1～3。其中JNK1、JNK2基因在全身范围内均有表达，在病理过程中起到重要作用，特别是免疫系统;JNK3仅表达于心脏、脑、睾丸，在神经系统中发挥作用，特别是神经细胞凋亡〔8〕。

MKK4为MAPK信号通路的重要成分，可激活JNK通路起到诱导细胞凋亡、限制肿瘤细胞生长的效果。JunD能够被JNK通路激活，起到防止细胞凋亡的效果。microRNA.513a.5p能够通过激活MKK4来正向调节JNK通路;microRNA.494通过激活JunD来负向调节JNK通路。以上可能为人类机体的一种自我保护机制，在退变间盘中同时存在有凋亡和抗凋亡两种机制，形成一种动态平衡，使得退变无法在短时间内完成。

1 李 翔，李新志.腰椎间盘退变基因治疗的研究进展〔J〕.中国全科医学，2013;16(33):3895-7.

2 叶 伟.炎性因子在腰椎间盘退变机制中的作用〔D〕.中山:中山大学博士学位论文，2006.

3 马秀才，沈 霖.腰椎间盘退变分子生物学因素研究进展〔J〕.中国矫形外科杂志，2011;19(17):1451-3.

4 耿 翔，吕国华.聚集蛋白聚糖基因多态性与腰椎间盘退变相关性的研究进展〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2013;23(4):370-2.

5 孙正明，刘 淼，张银刚，等.腰椎间盘退变相关基因的研究〔J〕.中华骨科杂志，2008;28(6):516-9.

6 陈文杰，王洪立，姜建元，等.微生物学因素在椎间盘退变中的研究进展〔J〕.中华骨科杂志，2014;34(8):872-4.

7 刘 浩.环境因素和ADAMTS-4多态性与腰椎间盘退行性疾病相关研究〔D〕.北京:北京协和医学院(中国医学科学院)博士学位论文，2011.

8 丁文元，曹来震，申 勇，等.退变性腰椎侧凸形成和发展的相关因素分析〔J〕.中华外科杂志，2011;49(5):404-8.