药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）概要

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

前言

药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来，随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国食品和药品管理局（FDA）已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及42个药物基因组生物标记物。此外，部分行业指南也将部分非FDA批准的生物标记物及其特性（如MGMT基因甲基化）的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。

药理学与遗传学结合的关键环节包括药物代谢动力学（PK）和药物效应动力学（PD）两方面。药物代谢动力学主要是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，侧重于阐明药物的体内过程；药物效应动力学主要研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制，其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化，侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。

本指南旨在为个体化用药基因检测提供一致性的方法，所指的药物基因组生物标志物不包括影响抗感染药物反应性的微生物基因组变异。此外，肿瘤靶向治疗药物个体化医学检测指南见《肿瘤个体化治疗的检测技术指南》。

本指南起草单位：中南大学湘雅医院临床药理研究所、中南大学临床药理研究所、中南大学湘雅医学检验所，并经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国药理学会药物基因组学专业委员会、中国药理学会临床药理学专业委员会和中华医学会检验分会组织修订。

本指南起草人：周宏灏、陈小平、张伟、刘昭前、尹继业、李智、李曦、唐洁、俞竞、彭静波、曹杉、成瑜。

1 本指南适用范围

本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，旨在为临床检验实验室进行药物代谢酶和药物靶点基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床实验室。

2 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述

药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）个体差异。药物基因组生物标志物的检测是临床实施个体化药物治疗的前提。从药物代谢酶和药物作用靶点基因出发，对个体化用药基因检测的适应人群、标本采集、运输、接收、处理、样本检测、结果报告与解释、室内室间质控需遵循的基本原则，以及可能出现的问题与应对措施等方面的内容进行介绍，可为基于药物代谢酶和药物作用靶点的基因检测提供标准化指导。

3 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证

根据临床检验实验室的条件确定合适的分子诊断项目和恰当的样本处理是确保核酸定性定量检测准确性的关键。检测前必须确保标本的采集、运输和储存符合要求。标本处置不当可能引起核酸降解，导致定量检测结果不准确。

3.1 采样前准备

3.1.1 分子诊断项目的申请与完善：药物代谢酶和药物作用靶点基因检测在采样前需填写规范的申请单，申请单应包含足够的信息，以识别患者和有资格开具申请单的临床医生。临床医生应根据临床需求合理选择分子诊断项目。个体化用药领域发展迅速，临检实验室应加强与临床医师的沟通，及时指导临床医师选择有价值的诊断项目，帮助医师合理解释检验结果；不断接受正确合理的临床医师的反馈意见，及时了解临床对个体化用药分子检测的需求，优化项目目录。实验室应根据其具体的工作流程确定质量监测指标，如患者诊断信息完整率、适当临床判断率等，并定期对数据进行回顾性分析，定期对检验申请进行评审。

3.1.2 患者的正确识别及知情同意：患者的正确识别是确保获得正确临床标本的前提。收集标本的容器上应注明患者的信息，通常应包括姓名、送检医院及科室、住院号等。医护人员在采样前需首先核对确定患者的身份，核实标示患者的信息。

标本收集前应向患者介绍个体化用药基因检测的意义，以得到患者的认同，即知情同意。采样前需告知患者所检测项目的目的、意义、基本过程、项目可能存在的不足（如检测结果可能出现与临床用药实际不相符的情况）、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研项目）及保存时间，保护受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据）。对实施有创检查的分子诊断项目如穿刺取活检组织，应清楚地告知患者及家属检查可能遇到的风险和紧急情况下的预案。知情同意书是医方履行如实告知义务的证据，也是患者行使选择权的书面依据。

3.1.3 送检单的填写与项目的复核：标本采集前需填写送检申请单，提供受检者必需的信息。申请单需填写的信息包括：申请的检测项目、标本编号、受检者姓名、性别、出生日期、民族、采样日期及时间、标本来源（组织类型）、相关临床资料（如身高、体重、疾病诊断、疾病分型分期、合并疾病、用药情况）、采样单位及科室名称、送检医师姓名等信息。临检实验室应有专业人员根据信息采集表对检测项目的合理性进行审核，必要时可与送检医师讨论。

3.2 标本采集：临床分子诊断实验室应对各种个体化用药分子诊断临床标本的采集按检测要求建立标准操作程序（SOP）。标本采集人员应经过系统的培训。采样前应对标本采集容器进行评价，确保容器本身不会干扰测定过程，并保存评估记录。用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本在采集时间上无特殊要求。静脉血液采集之前应按要求对预采血的部位彻底消毒。肿瘤组织中DNA的分析利用常规诊断所用的标本即可，但用于RNA分析的标本需专门采集，并准备好液氮等速冻所需的材料及设备。标本采集需要在密闭、一次性采样系统中完成，所用的材料如注射器、棉签、拭子等应为一次性使用，以防止污染。无论采集哪种类型的标本，采样时都必须戴手套，以避免标本中病原微生物感染和皮肤脱落细胞对标本的污染。

用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本类型有多种，包括全血标本、 组织标本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺标本）、口腔拭子、骨髓、胸腹腔积液等。样本采样原则见《个体化医学检测质量保证指南》。

3.2.1 全血和骨髓标本：全血标本采集到含有适当抗凝剂或添加物的采样管中，添加物根据被测量种类（细胞内DNA、 RNA）、检测项目和采样体积而定。因肝素可抑制PCR反应中酶的活性，全血或骨髓标本一般用EDTA或枸橼酸盐抗凝。采样前需在采样管或注射器上标注标本信息。全血标本采集外周静脉血2～3 ml并置于采血管中，将采血管轻轻颠倒混匀数次以确保充分抗凝，避免溶血。如检测目的是细胞内RNA，建议用含RNA稳定剂的采样管，或采样后尽快将全血或骨髓加入到RNA稳定溶液中。采集干血斑标本时，可向无菌滤纸上滴加约50 μl全血，根据需要可连续在数个印圈上滴加标本，于室温自然干燥至少4小时。干血斑标本采集时不要堆叠血斑，不与其他界面接触，待血斑充分干燥后应放入无菌袋中，避免血斑之间的相互污染，同时加入干燥剂和湿度指示卡，密封包装后运送。

3.2.2 组织标本：当待检测的组织与血液或口腔脱落细胞基因型不一致时，或当组织是待测核酸必须的来源时（如检测肿瘤组织中mRNA表达、融合基因、基因扩增或缺失、甲基化水平、微卫星不稳定等），需采集组织标本进行检测。可用的组织标本包括新鲜组织、活检组织、石蜡包埋组织和石蜡切片。

① 新鲜组织和活检组织：采样大小取决于组织类型。一般而言，无论是哪种组织类型，在没有大量脂肪细胞侵润的情况下，10 mg组织标本可提取DNA或RNA 10 μg。无菌条件下，取米粒大小手术或活检组织（约25 mg）；肿瘤组织要求未坏死肿瘤组织比例＞70%。穿刺取实体肿瘤组织时，取得的细胞数与穿刺针的粗细有关，21G细针每次获得≥100个细胞，19G细针每次获得≥150个细胞，支气管活检每次获得≥300个细胞，CT介导的细针穿刺每次可获得≥500个细胞。通常检测时标本中肿瘤细胞的数量需达到200～400个。在某些情况下，要求同时采集无病变的组织或外周血作为对照（如微卫星不稳定性检测）。组织块取样后的处理与保存见《个体化医学检测质量保证指南》。

② 石蜡包埋组织：推荐用10%中性缓冲甲醛溶液固定组织标本，避免使用含重金属离子的固定液（如Bouin液）等。甲醛介导的DNA损伤在固定3小时后明显发生，且时间越长，DNA损伤越严重。因此，推荐较小的组织（如活检组织标本）固定6～12小时，较大的组织（如手术切除标本）固定6～48小时。甲醛固定的石蜡包埋组织不适于用作RNA检测，但在没有其他标本可供选择时，可考虑选择没有污染部分提取的RNA用于检测，待测RNA序列的长度最好＜130 bp。组织标本切片时应特别注意避免标本间的交叉污染。

③ 组织切片：用于DNA检测时，手术标本需提供10 μm厚的石蜡切片4～8张，面积为成人拇指盖大小；活检穿刺标本需提供10 μm厚切片8～10张。所有切片均为白片。肿瘤组织切片应在HE染色后，经病理医师显微镜下观察，以判断是否含有肿瘤细胞及肿瘤细胞的数量是否足够（一般要求＞50%）、坏死组织比例＜10%，并在对应的白片上画出癌巢，对肿瘤细胞密集区域进行标注。DNA测序法要求肿瘤细胞至少占组织细胞的50%。应采取措施避免核酸交叉污染，制备不同患者病理切片标本时，需更换新刀片。

3.2.3 口腔脱落细胞：口腔脱落细胞可同时用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，将消毒医用棉签伸进口腔，在口腔内侧脸颊粘膜处左右反复擦拭20次左右，取出棉签，将棉签置于干净滤纸上阴干，每位受检者至少采集棉签3根。棉签立即放入干净封口塑料袋内封闭并放入纸质信封，信封上应做好详细标记。滤纸应经过灭菌处理，以防细菌生长抑制核酸酶的活性。漱口标本也可作为口腔脱落细胞的来源。用于RNA分析的口腔脱落细胞必须保存在RNA稳定剂中。

4 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析中质量保证

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测必须有严格的质量控制措施，涉及基因扩增的检测项目必须在通过技术审核的临床基因扩增检验实验室完成。分析中质量控制的内容包括：实验室设计的要求；检测程序的选择、验证及确认；仪器设备的使用、维护与校准；人员培训；样本的准备（如核酸纯化等）；执行检测；确认检测结果的可靠性。实验室应制定室内SOP和参加室间质评或实验室间比对。

4.1 实验室设计要求：原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。作为药物代谢酶和药物作用靶点基因检测核心技术之一的PCR，要保证结果的可靠性和准确性，首要措施就是防“污染”。检测实验室应按《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》要求进行设置，并按要求严格控制空气流向，避免PCR产物污染。

4.2 检测方法：药物代谢酶和药物作用靶点基因检测过程一般包括核酸提取和靶标检测两个阶段。

用于靶标检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交（ISH）等多种方法，每种方法的原理和优缺点如表1。

① PCR-直接测序法：也称PCR-Sanger测序，该方法基于双脱氧核糖核酸（ddNTP）末端终止法，根据核苷酸在某一固定点开始延伸，随机在某一特定碱基处终止，由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记，因此产生了以A、T、C、G结束的4组相差一个碱基的不同长度系列核酸片段；通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法。由于该方法可直接读取DNA序列，因此被认为是基因分型的金标准。

② PCR-焦磷酸测序法：本方法是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。实验需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。所需试剂包括样本处理试剂、核酸扩增试剂、单链模板制备试剂、焦磷酸测序试剂和阳性质控品五大类。所需仪器为PCR仪和焦磷酸测序仪。为避免假阳性和假阴性结果，应严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止因试剂污染致假阳性发生。

③ 实时荧光PCR法：根据检测原理的不同，实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。Taqman探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术，其在反应过程中使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异性探针，两条为PCR引物。两条探针可分别与突变型和野生型模板互补，其两端分别应用含报告基团和淬灭基团的染料进行标记，两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行单核苷酸多态性（SNP）检测时，PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合，当引物延伸至探针处时，DNA聚合酶5’端外切酶活性将探针的5’端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发出荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。

表1 各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较

④ PCR-基因芯片法：该方法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。基因芯片分型法的操作过程包括PCR核酸扩增、杂交、芯片扫描和结果分析。

⑤ PCR-电泳分析：该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物大小对基因多态性位点进行基因分型。该方法属于定性检测，且只能用于对已知的多态性位点进行检测，不能识别未知多态性位点。琼脂糖凝胶电泳法适用于对片段较长的插入缺失多态性进行检测，如血管紧张素转化酶（ACE）插入缺失多态性；毛细管电泳法适于对较短的插入缺失多态性如UGT1A1*28多态性和微卫星不稳定性（MSI）进行检测。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。

⑥ PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）法：该方法通过对PCR反应的熔解曲线分析进行基因分型。PCR扩增的熔解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的差异都可导致双链DNA的解链温度发生变化。HRM法应用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化，确定所扩增的目的片段中是否存在突变，从而用于基因分型。HRM法分析使用LC Green等饱和荧光染料，该类染料在饱和浓度时对PCR反应无抑制作用，因此可以高浓度使用，从而全部结合DNA双螺旋结构中的小沟。在双链DNA的变性过程中不存在荧光分子的重排，其特异度得到大幅提升，因此，熔解曲线细微的变化可以反映扩增片段中碱基的差异。应用本方法进行基因分型属于定性分析。

⑦ 等位基因特异性PCR（AS-PCR）：又称为扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）。该技术的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端错配的碱基会导致引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。因此，AS-PCR反应需要两条等位基因特异的引物和一条共用的反向引物，两条非特异性引物在3’端与模板错配，但其他部分碱基序列完全一样。只有引物的3’端与模板完全配对时，PCR扩增才可以进行。PCR产物可通过凝胶电泳进行分析和基因型的判断。该方法也可与实时荧光定量PCR结合起来进行基因分型。该方法可以用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测，缺点是假阳性率较高。

⑧ PCR-限制性片段长度多态性方法：限制性片段长度多态性方法（RFLP）是一种基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列和结构DNA，并对其进行剪切的原理。限制性内切酶通常识别双链DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近将双链DNA切断，从而产生较短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化都可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。因此，对位于限制性酶切识别位点的SNP进行分型时，可以使用包含该位点的PCR产物与相应的限制性内切酶进行温育。将酶切产物进行电泳，并根据酶切产物片段的大小来进行基因分型。该方法不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。但缺点也很明显，主要是通量太低，大量分型时工作量大，并且只适用于部分SNP分型。

⑨ 原位杂交（ISH）法：ISH法以各种人体标本，包括相应实验方法制备的细胞学和组织学标本（福尔马林固定石蜡包埋）作为靶标，采用目的DNA探针与该靶标进行分子杂交，从而检测相关的靶基因异常。ISH技术按照探针标记物的类型，可分为亮视野原位杂交和荧光原位杂交（FISH）。ISH法检测的靶标具有完整的细胞核，无需进行核酸的提取。其具体的方法学原理见《原位杂交 （ISH）指南》。在药物代谢酶和靶点基因检测中，ISH法主要用于测定基因扩增和基因缺失异常。

4.3 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及类型（表2）：遗传药理学知识库（PharmGKB）根据项目成熟程度将个体化用药基因检测项目分为4级，并认为其中1级项目（包括1A级和1B级）满足临床应用的最高标准，而4级项目适于临床应用的证据最少。1A级项目为同时获临床遗传药理学实施联盟（CPIC）、认可CPIC药物基因组学指南的医学会、以及美国国家卫生研究院药物基因组学研究网络（PGRN）认同的项目，这类项目通常经大规模随机对照临床试验（RCT）对项目的意义进行了论证；1B级项目有确切的临床证据提示相关性，且这种相关性被具有一定样本规模的研究所证实，但还需进一步的临床证据。根据检测项目所涉及的基因在影响药物反应中的作用机制和靶分子（DNA或RNA）的不同，个体化用药分子检测项目包括药物代谢酶与转运体基因遗传多态性检测、药物作用靶点基因遗传变异检测、其他基因变异检测和药物作用靶点基因mRNA表达检测四种类型。

4.4 仪器设备的使用、维护与保养：原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测涉及的仪器设备众多，实验室可参考生产商提供的操作说明书编写书面的、有案可查的预防性维护及校准计划，确定仪器设备的维护周期，建立仪器设备日常维护的SOP。对于某些计量分析仪器，应依照我国计量法规定，由计量检定机构定期进行校验，并保存好校验证书。加热系统及冰箱等设备的维护包括对温度进行监测。仪器维护过程中要注意清洁剂的使用，尤其是仪器的光路系统。每台仪器应该配备专用的清洁工具。在例行仪器的维护和保养后，应填写仪器维护保养记录表。如维护中发现问题，应及时汇报并将出现的问题详细记录，最后由维护操作人员签名。

4.5 人员培训：原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测通常要涉及试剂配制、核酸提取、仪器编程、结果分析和报告等步骤。操作人员需要有一定的专业技术知识和经验才能获得稳定可靠的检测结果。

加强人员培训是确保检测质量的关键。人员培训分为入职培训、内部培训和外部培训。通过培训，让操作人员掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具备独立进行质控活动和仪器维护的能力、可对试剂和质控品的出入库及使用情况、设备保养等情况进行准确记录，进行数据分析。实验室工作人员在培训后书面确认其已接受适当的培训，阅读并理解了相关SOP。实验室应对其工作人员进行处事能力考核和周期性能力再考核，定期开展内部培训。外部培训包括国家卫生计生委临床检验中心和国家卫生计生委个体化医学检测培训基地等机构组织开展的各种技术培训。

4.6 检测体系的性能验证：原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。临床检验实验室应用的体外诊断试剂包括国家药品食品监督管理总局（CFDA）批准的试剂盒和国家卫生计生委个体化医学检测试点单位通过性能评定，具有严格SOP的自配试剂（LDT）。所有试剂都需进行性能评价。实验室所购买的商业化仪器应根据说明书进行验证。在报告结果之前实验室应该证明其性能能够满足厂家规定的准确度、精密度、线性与可报告范围和参考区间。实验室还应该为每个检测系统建立性能规范，包括适用性、准确度、精密度和分析特异性（包括干扰物质）、可报告范围和其他重要特性，并根据性能规范确定系统的校准和质控程序，保持性能特征建立、校准和质控程序相关活动的记录。同时也需对检验中的耗材进行质检。

表2 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导

个体化医学分子检测包括定性检测和定量检测。定性检测的性能验证指标主要包括重复性、精密度、准确度（突变型的检测能力）、分析特异性、检出限等，可参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）的EPl2-A2文件进行检测。定量检测监测体系性能验证的指标主要包括准确度、精密度、线性、可报告范围、检出限、参考区间、灵敏度、特异性等。

线性分析可直接分析已知浓度的样品，也可将一定浓度的样品进行系列稀释后，根据稀释因子来研究检测值与逐步下降的预期估计浓度之间是否存在线性关系。可报告范围是能够报告的可靠的最低和最高检测结果，实验室可通过“多点法”进行简单验证，推荐应用5个不同浓度水平的样品进行验证。

LoD是指可被检测体系检出的最低检测浓度，又称最小检测浓度或检测底限。建立和验证LoD时，需同时建立、验证空白检测限。检出限一般由厂家、方法建立者完成，实验室LDT试剂应确立方法的LoD。LDT试剂的性能评估包括样品的类型与数量、所选择的参比方法、评价指标、准确度、重复性与精密度、线性范围、检测范围、分析的灵敏度与特异性、参考区间或临界值（cut-off）及临床性能评估结果。具体可参考国家卫计委《个体化医学检测LDT研制技术规范》。

5 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析后质量保证

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。分析后质量保证包括检测报告、结果解释、报告发放与咨询、检测后样本的保存和处理。

5.1 检测报告的内容、解释及发放

5.1.1 检测报告的内容及要求：检测报告应通俗易懂，应在尽可能避免歧义的情况下客观地解释结果，以确保临床医生能正确解读。

报告单要求有统一的格式和书写内容要求，报告应包含的内容：医疗机构或实验室名称、项目名称、标本编号或条码、送检单位及（或）科室名称、患者信息（姓名、性别、年龄）、标本类型、标本采集与接收时间、送检医生姓名、疾病诊断、报告单出具的时间、标本处理过程、检测方法和主要设备、检测过程、检测结果并附相关图表、结果解释、用药方案建议、检测的局限、必要的参考文献、检测人员、审核人员和复核人员签字、结果报告日期和备注、检测单位联系信息。

检测结果应以清晰易读且易被医师和患者理解的形式进行报告，报告单上应采用标准化的基因命名和计量单位。定量检测应注明参考区间、检测方法的线性或测定范围；定性检测可直接写基因型、基因扩增有无、微卫星不稳定的程度（低、中、高）、甲基化有无等。

5.1.2 检测结果的解释：根据药物基因组生物标志物检测指导个体化用药主要包括两种类型：一是根据个体的遗传信息调整用药剂量，以增加药物疗效，减少药物不良反应的发生；二是根据个体的遗传信息确定用药的种类，避免应用针对特定基因型个体无效或可能产生严重药物不良反应的药物。

药物剂量的调整往往需根据RCT的结果；对目前缺乏RCT的遗传变异，可依据基因型对影响药物的药代动力学曲线下面积大小估算用药剂量；当一个药物的反应性受多个基因或基因与环境因素间相互作用影响时，可根据国内国际大规模临床试验推导出的纳入了个体基因型及其他因素的用药剂量计算公式确定用药剂量。

常见药物代谢酶和药物作用靶点基因遗传变异检测结果对临床用药的指导建议见表2。

5.1.3 检测结果的报告流程与发放：检测报告通常以纸质报告单形式或以电子版通过网络形式发放。药物代谢酶和靶点基因检测结果报告需要有严谨有效的流程，以确保检验信息的完整、有效、及时、正确、隐私。首先要对检测结果报告进行审核分析，包括审核检测过程的有效性、受检者的基本信息、结果数据分析。审核者应当是主管技师以上的工作人员、本专业实验室负责人、高年资检验人员和临床实验室主任授权人，审核者对检验报告的质量负责。

通过审核的检测报告可以报告单形式或通过检测实验室的信息管理系统发放。应建立检测报告单发出和管理制度。明确检测结果报告发放的程序和责任，设定并公示检测结果报告时间，报告时间是指从接受送检标本起，到检测结果发放的时间。应制定个体化用药基因检测数据管理制度，数据中应录入患者信息和检验数据；检测数据的修改必须征得报告结果签发人员同意后，由操作人员进行修改；所有检测报告和原始记录应当归档保存，实验室信息系统数据至少要拷贝3份并保存在不同的地方，以便日后核对。一般检验报告单和检测结果数据至少保存两年；室内质控和参加室间质量评价的记录和质控信息至少保存两年；仪器状态和维修记录要保留到仪器使用终身。检测结果的查询通常可根据患者姓名、标本编号、检测项目和送检日期进行查询。

检测报告发放后收到检测报告投诉需记录并统计，分析原因，避免二次错误。

5.1.4 检测后咨询服务：个体化医学分子诊断实验室应配备相关资质、取得国家卫生计生委个体化医学检测培训基地培训合格证的个体化用药咨询人员，对检测项目提供咨询服务，负责对检测报告在临床上出现的各种情况进行解释和检后服务。

5.2 检测后样本的保存和处理：样本完成检测后要进行一定时间（尽可能长期）的保留，以备必要时复查。标本的保存也可为科研工作的开展和回顾性调查提供条件。完成检测后剩余的DNA样本至少在-80℃保存2年。DNA在-70℃的环境下可保存至少7年。纯度不高的DNA样品建议保存在-20℃或更低的温度中，以确保DNA的完整性。在不影响受检者个人隐私及利益的前提条件下，DNA及临床资料也可匿名用于科学研究，但需在知情同意书中明确。废弃的样本应作为生物危险品处置。

6 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量保证

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量控制与保证是个体化医学检测质量保证的核心内容，是个体化用药基因诊断规范化和标准化的首要前提。因此，临床检验项目的计划和准备，试验性能确认/验证以及检验全过程都需要建立有效的质量控制体系。

6.1 检测确认和特征描述：在将检测用于临床工作之前应该对方法进行分析确认和临床确认。实验室应确定待检测的靶核酸、确定要使用的试验方法和建立试验性能确认/验证的计划和程序。确认/验明程序应该包括：检验目的；靶基因，基因序列和突变；预期患者人群；被比较的试验方法，或要使用的方法；使用的样本类型；要确定的分析性能特征；参考材料的来源；如何分析性能规范；如何规定试验的局限性；出现问题时的纠正措施。

6.2 可操作性的SOP编写：有可操作性的SOP是个体化医学检测实验室质量管理的灵魂。SOP源于仪器和试剂说明书、一些标准文件和实验室实验工作经验的积累，应包括试剂准备、标本采集、标本接收与预处理、核酸提取、测定方法、结果分析和报告、仪器操作、实验室安全措施等临床检验的各个环节。SOP的编写应注意通俗易懂、注重细节、清晰明了、图文并茂。实验室工作人员应严格遵循SOP中的步骤要求进行操作，当发现SOP有“故障”时，经过技术研发小组的工作人员讨论、实验验证后及时修改。

6.3 质控品与室内质控

6.3.1 质控品：所有药物代谢酶和药物作用靶点基因检测都需要选择一定的质控样本进行质控分析。质控样本的选择视检测项目而定，如药物代谢酶的SNP检测的阴性质控样本可以是无相关突变的同类样本和不含任何核酸的水样本，阳性质控样本可以为以前检测过的特定基因突变已知的样本或体外构建的已含特定突变质粒的细胞株。常用的做法为：在每次检测时同时设立试剂对照、阴性质控、阳性质控、弱阳性质控，且这些质控样本与待检样本同时进行检测，每隔一定数量的临床标本插入一份质控样本。当同时检测多个变异位点时，可根据实验室的条件设立针对2～3个位点的阴性或阳性对照，但不同批次间要注意更换阴性和阳性对照样品。

质控样本的质量与实验结果的可信度密切相关。理想的室内质控样本应该具有以下特点：基质一致，即与待测样本具有相同的基质；稳定性好，在适当的储存条件下能保持较好的稳定性；检测结果应该是确定的，且越接近试验的决定性水平越好；具有安全性，不得有生物传染危险性；单批可大量获得，以便于长期连续监测。

6.3.2 室内质量控制的方法：应用统计学原理或非统计学方法判断测定批次的结果是失控还是在控，是室内质控的核心。室内质量控制的方法包括统计学质量控制和非统计学质量控制两大类。一般而言，定性检测（如基因分型）采用非统计学质量控制，而定量检测如基因表达水平检测、基因甲基化水平测定、以及实验室“污染”所致的假阳性定量检测一般采用统计学质控。统计学质控主要从不精密度和偏离度两个方面确定检测程序或分析方法稳定性的性能特点，其具体做法是在常规检测临床标本时，除阴性质控外，还要对连续的一个浓度梯度的阳性质控样本进行检测，分析判断质控样本的测定结果是否偏出所用方法的测定范围，进而决定常规临床测定标本结果的有效性。统计学质量控制的前提是制定在最佳条件和常规条件下实验室变异的基线。在进行不精密度测定时，一般至少对20个不同的样本连续检测不少于20天，每天2次。偏离度的测定可采用基准线法、与参考物质的检测结果比较、与其他平行单位的检测结果比较、与其他方法的检测结果比较等多种方法。部分定性检测方法因可计算出样本中突变等位基因的比例，也可应用统计学质控方法进行质控分析。

统计学质量控制方法主要包括两大类：阳性样本测定重复性统计质控方法和假阳性的统计质控方法。阳性质控品测定重复性统计能较准确地反映实验室仪器、试剂、实验员操作的稳定性，也是实验室实时监控检测结果是否可信的重要手段，其主要统计控制方法包括基线测定、Levey-Jennings质控图方法、Westgard多规则质控方法、累积和（CUSUM）质控方法及“即刻法”质控方法。假阳性的统计质控方法包括根据日常患者检测结果阳性率的Levey-Jennings质控图和直接概率计算法两种，其中Levey-Jennings质控图法是目前临床检验中应用较为广泛的一种方法，适合于质控样本多次重复、检测结果可用数值表示且呈正态分布的情况。

Levey-Jennings质控图法的具体做法是：样本处理（核酸提取）时加入流程阴参，所有步骤与待测样本一致；加模板时，各检测位点均应设置阴性对照（即以流程阴参为模板，用于检测是否发生“污染”）与一定比例的突变型/野生型阳性标准品。PCR扩增时注意前后批次阴参和阳参的孔槽摆放位置的随机性。所有阴参、阳参的检测结果应符合预期值，记录各个阳性质控品PCR扩增产物检测结果。用Levey-Jennings质控图进行统计分析，根据质控规则判断检测结果是否在控。质控规则如下：

12S：1个质控测定值超出X±2S控制线，预警；13S：1个质控测定值超出X±3S控制线，失控；22S：同一批次2个连续的质控测定值或不同批次的2个质控测定值同时超出X+2S或X-2S控制线，失控；R4S：同一批测定中，2个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4S控制线，失控；41S:4个连续的质控测定值同时超出X+1S或X-1S控制线，失控；7T：7个连续的质控测定值呈现出向上或向下的趋势，失控；10X：10个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧，失控。

只有当使用所有质控规则判断确定测定值在控时的检测结果方为可信结果，而只要上述质控规则之一判断测定值失控即认为该测定值失控。阴参检测结果为阳性，也判定为失控。一旦失控出现，当日所有检测结果无效，必须暂停实验并及时查明原因，采取改进措施，直至测定结果在控后方可重新开始临床检测。每次出现失控情况需填写失控记录，详细记录失控原因、采取措施及其效果，失控报告应及时通报公布，以免反复出现同一原因导致的失控。

6.4 室内质量控制的评价：实验室应有专人对实验过程各个阶段及实验数据进行质检。在日常临床诊断服务过程中，如果发现阳性质控标本结果偏高、偏低或检测为阴性，或阴性质控品检测为阳性，则应立刻查找失控原因，并采取预防措施。

阳性质控品失控常见的原因包括：模板问题、引物或探针问题、仪器问题或试剂问题。应对策略包括：纯化核酸、高浓度小量分装、避免核酸反复冻融、换用新的检测试剂、标本重复双份测定、对可能含PCR扩增抑制物的标本进行稀释等。

阴性质控品呈阳性提示核酸“污染”，污染来源可能是扩增产物和（或）核酸提取过程中的交叉污染。如果临检标本全为阳性，提示扩增产物或试剂污染，应更换试剂或进行实验室清洁、通风；如果临检标本部分阳性、部分阴性，考虑为扩增产物轻度污染或标本间交叉污染，可通过对5～8份水样品进行检测，查明污染来源，阳性提示实验室污染，则应进行实验室清洁、通风，阴性要提醒临检人员注意操作过程。

6.5 室间质量评价：临床检测实验室应参加室间质量评价（EQA），对待EQA样本不能特殊化，详细、如实地记录参与EQA的全过程，根据反馈结果了解本实验室的能力，自查存在的问题，及时寻求改进方法，解决问题，完善实验室质量控制体系，以促进实验室更好的发展。EQA评分包括绝对评分和相对评分。绝对评分就是看实验室对该次所有质评样本检测结果与预期结果相符的标本总数占该次全部样本的百分比，大部分项目绝对评分大于80%即可视为检测结果满意或合格。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的EQA还需对检测报告的填写规范程度、文字错误、报告清晰度、结果报告揭示的充分性等进行评价。

为保证室间质评的质量，需要注意以下几点：① 参加质评实验室报告结果要清楚、简洁；② 参加质评实验室使用与常规样本完全相同的方法来测定室间质控样本；③ 室间质评报告要迅速及时；④ 室间质评样本的来源和浓度与临床患者标本要尽量一致；⑤ 室间质评样本必须在发放条件下稳定；⑥ 不存在不可避免的传染危险。

7 制 度

临床检验过程中需遵守国家对医疗机构和临床检验实验室的其他相关规定。

① 医疗机构及临床实验室相关管理条例：《医疗机构管理条例》 《医疗机构临床实验室管理办法》《医疗机构临床基因扩增管理办法》《医疗机构临床检验项目目录》《医疗质量控制中心管理办法（试行）》《实验室质量手册》《医学检验所基本标准（试行）》。

② 标本处理的相关条例：《血站质量管理规范》《血站实验室质量管理规范》《血液标本留取程序》《血液检验样本目测检查标准》《血液的贮存发放与运输管理程序》和《血液样本接收处理标准操作规程》。

③ 医疗废物处理的相关条例：《医疗废物管理制度》。