侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

王莉爽++陈文++谭清群++吴石平++袁洁

摘要 根据已报道的黄瓜花叶病毒（CMV）外壳蛋白（CP）基因序列合成1对引物，对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明：40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%～100.0%，与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%～98.2%，亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%～80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切，因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。

关键词 烟草；黄瓜花叶病毒；株系分化

中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）17-0141-02

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，在全球均有分布[1-2]。CMV由60多种蚜虫非持久性传播，能侵染85科365属1 000多种单子叶、双子叶、木本及草本植物[3]。CMV株系变异较多，世界上报道的有100多个株系。Palukaitis等根据寄主范围、症状反应、血清学以及CP序列差异将CMV分为亚组Ⅰ和亚组Ⅱ[4]。Roossinck等基于基因组RNA3的5′端的非编码区序列将亚组Ⅰ进一步分为亚组ⅠA和亚组ⅠB[5]。CMV划分亚组和株系的方法很多，其中分子生物学方法的CP基因同源性分析比较是研究黄瓜花叶病毒亚组鉴定和株系划分最根本、最可靠的方法。由于CMV是生产上侵染烟草的重要病害之一，严重地影响烟叶的产量和质量。

本研究对贵州省烟草不同主产区中侵染烟草的CMV分离物CP基因进行了序列比较，确定贵州CMV分离物所属亚组，为抗病育种、品种引进等研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品。烟草病毒材料为2013—2014年在兴义、兴仁、威宁、福泉、道真等20个县市40个乡镇采集并检测出的黄瓜花叶病毒阳性样品（表1）。

1.1.2 引物合成。参考相关文献报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列引物[6]，该引物由上海生物公司合成，序列为：CMV-F：ATGGACAAATCTGAATCAACC，CMV-R：TAAGCTGG ATGGACAACCCGT。

1.2 试验方法

1.2.1 血清学检测。疑似样品粗汁液用美国Agdia公司的DAS-ELISA检测试剂盒进行检测，检测方法参照试剂盒说明书进行。

1.2.2 病毒RNA的提取。采用柱式病毒提取试剂盒（上海生物工程公司生产）提取烟草病毒RNA。

1.2.3 cDNA合成及PCR扩增。采用RT-PCR两步法对PVY的P1基因序列和CP基因序列进行扩增。第1链cDNA合成反应体系体积为20 μL，其中，RNA 2 μL，下游引物1 μL，5×RT Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV反转录酶1 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：65 ℃ 5 min，迅速插入冰上5 min，42 ℃延伸60 min。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 mmol/L正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 5 μL，补加灭菌的ddH2O至50 μL。反应程序为94 ℃预变性2 min后开始以下循环：94 ℃变性1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；循环结束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。反应结束后取2 μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果。

1.2.4 克隆与测序。RT-PCR扩增产物经DNA回收试剂盒连接到载体，转化到大肠杆菌DH5a，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆，送上海生物工程公司进行双向测序。

1.2.5 核苷酸序列分析。利用DNAman Version 5.0软件进行序列拼接和分析；以获得的CP基因序列为基础，用Mega5.0程序 的邻近连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建TMV病毒CP基因组序列的系统进化树，其各分支的可信度用Bootstrap检测（1 000次重复）。用于CP基因比较和分析的TMV病毒及其序列登录号如表2所示。

2 结果与分析

2.1 血清学检测结果

145份烟草病毒病疑似病标样经DAS-ELISA检测，共检出86份CMV阳性样品。

2.2 RT-PCR扩增

选出具有地方代表性的CMV分离物进行RT-PCR扩增，40个黄瓜花叶病毒贵州分离物均扩增出约780 bp预期目的片段，没有其他非特异性DNA条带。

2.3 序列测定与分析

用DNAman Version 5.0对40个CMV贵州分离物CP基因进行序列比对和分析，结果显示：CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%～100.0%，氨基酸同源性为94.6%～100.0%；与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%～98.2%，氨基酸同源性为93.3%～97.7%；亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%～80.5%，氨基酸同源性为76.5%～78.8%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切，因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。从构建的系统进化树可知（图1），40个贵州CMV分离物聚在一起与CMV株系亚组IB系列聚为一个大支，说明与亚组ⅠB系列亲缘关系较近；CMV株系亚组ⅠA系列单独聚为一支；CMV株系亚组Ⅱ单独为一支，且与CMV分离物离的最远，说明CMV分离物与亚组Ⅱ的亲缘关系较远。40条贵州CMV CP基因序列分为两大支，遵义地区、铜仁地区、贵阳地区、黔东南州和黔西南州的县市34条CMV分离物聚为第一大支；黔南州6条CMV分离物聚为第二大支。但是在第一大支中施秉、黄平、遵义、湄潭、印江、思南和威宁聚为一个亚支；兴义、兴仁、盘县、贵阳、开阳和安顺聚为一个亚支；平坝、赫章、黔西和大方聚为一个亚支，分为2个小亚支，平坝单独为一个小亚支，其余3个县的CMV分离物为另一个小亚支。说明贵州CMV分离物在不同的区域存在一定的差异。endprint

3 结论与讨论

研究结果表明：40条贵州CMV分离物CP基因与CMV株系亚组ⅠB CP基因的核苷酸相似性和氨基酸同源性均较高，因此贵州CMV分离物属于CMV株系亚组ⅠB系列。本试验结果与山东、新疆石河子、伊宁地区的黄瓜花叶病毒株系分化结果相符[7]。但是贵州CMV分离物中没有发现CMV株系亚组Ⅱ，然而刘 勇等报道的云南、福建和湖南采集的64个CMV阳性样品中，属亚组Ⅰ的样品为57个，占89.1%；属亚组Ⅱ的样品为10个，占15.6%；其中3个样品为亚组Ⅰ和亚组Ⅱ的复合侵染[8]。说明相邻省份间CMV的株系存在一定的差异，也可能是没有采集到CMV株系亚组Ⅱ的黄瓜花叶病毒样品，这有待于开展进一步的研究。

4 参考文献

[1] 谢联辉，林奇英，吴祖建.植物病毒名称及其归属[M].北京：中国农业出版社，1999.

[2] 徐平东，谢联辉.黄瓜花叶病毒亚组研究进展[J].福建农业大学学报，1998，27（1）：82-91.

[3] GALLITELLI D.The ecology of Cucumber mosaic virus and sustainable agriculture[J].Virus Research，2000，71（1/2）：9-21.

[4] PITA J S，ROOSSINCK M J.Mapping viral functional domains for genetic diversity in plants[J].Journal of Virology，2013，87（2）：790-797.

[5] ROOSSINCK M J，ZHANG L，HELLWALD K H.Rearrangements in the 5′nontranslated region and phylogenetic alqalyses of Cucumb er mo saicvirus RNA 3 indicate radiM evolution of three subgroups[J].Journal of Vimbgy，1999，73（8）：6752-6758.

[6] 姚明华，王飞，叶志彪.侵染辣椒的黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定及株系分析[J].华中农业大学学报，2009，28（4）：472-475.

[7] 程朝玲，向本春，崔百明，等.新疆石河子、伊宁地区黄瓜花叶病毒株系分化[J].植物保护学报，2013，40（2）：115-120.

[8] 刘勇，莫笑晗，余清，等.云南、福建、湖南烟区烟草花叶病主要病毒种类检测及黄瓜花叶病毒亚组鉴定[J].植物病理，2006，36（4）：310-313.endprint