饲料中粗蛋白测定的影响因素分析

丁进海

摘要 根据粗蛋白测定过程中的各个步骤研究了饲料中粗蛋白测定中消化炉的温度、消化炉消化的时间、催化剂用量、硼酸吸收液加碱量、蒸馏时间以及盐酸浓度等影响因素，并确定一些常规饲料中蛋白质测定的条件。试验结果表明，消化温度为420 ℃时效果最佳，消化时间最好控制在2 h以上，催化剂用量以6.4 g最为准确，硼酸吸收液是否加碱对测定结果影响较小，蒸馏时间在5 min之后蒸馏完全，盐酸的浓度选择则需要根据试样的大体粗蛋白含量进行选择，因此影响消化效果的因素主要有消化温度、消化时间、催化剂用量。

关键词 饲料；粗蛋白测定；影响因素；消化温度；消化时间；催化剂

中图分类号 S816.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）17-0302-03

粗蛋白是食品以及饲料中含氮化合物的总称，蛋白质是生命活动的基础，是构成生命体细胞、抗体、免疫激素、酶等的主要成分，也是人类以及动物个体补充能量的原料。特别是饲料中蛋白质含量的高低或者蛋白质的品质都很重要，关乎一些动物个体的生长速度、新陈代谢、繁殖发育，因此测定饲料中的蛋白质对于人类生活显得尤为重要。如今，随着人民生活水平的提高，对肉蛋禽类食品的需求量日益增加，而与其对应的饲料工业也快速发展和进步。虽然粗蛋白测定仍然无法鉴别三聚氰胺、尿素以及添加剂中某些含氮物质，但是粗蛋白质的含量也大体代表了饲料中蛋白含量，因此饲料中粗蛋白质含量的测定也越来越重要[1-3]。

粗蛋白检测方法有国标法、强碱直接蒸馏法、双氧水测定法、双缩脲法、凯氏定氮法，最常用的检测方法是凯氏定氮法。凯氏定氮法是影响因素易控制的方法，原理是试样与浓硫酸和催化剂一同消化，使蛋白质遭到破坏，使试样中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮，然后与硫酸结合生成硫酸铵，加入碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再以酸标准溶液滴定，测出含氮量[4-6]。

凯氏定氮法影响因素：消化温度对测定饲料中粗蛋白的影响，温度过高或者过低都会造成数据偏高，温度过低是因为消化不完全，温度过高会造成氮的散失；消化时间对测定蛋白的影响和消化温度差不多；催化剂影响了消化的速度；硼酸吸收液也会影响测定的精度；蒸馏时间对结果也会有影响；选用合适的盐酸浓度，对测定饲料中粗蛋白的含量精度也很重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验饲料选用大豆粕、进口鱼粉、玉米秸秆，其他试验仪器与试剂详见《GB/T6432—1994饲料中粗蛋白测定方法》[7]。

1.2 试验方法

1.2.1 凯氏定氮法测定饲料中的粗蛋白。蛋白质是一种含氮有机化合物，饲料中的蛋白质包括真蛋白和非蛋白氮，统称为为粗蛋白，凯氏定氮法适合一些配合饲料、浓缩饲料和一些单一饲料粗蛋白的测定[7]，将试样中的含氮物质经过催化剂和浓硫酸的共同消化，把试样中的含氮有机物转化成硫酸铵的形式，再经过凯氏定氮仪进行蒸馏，加碱，使硫酸铵中的氨反应生成氨气。再用硼酸吸收液将氨气或者氨水吸收，再用盐酸进行滴定，根据换算系数、计算公式，计算出试样中含有的粗蛋白含量。

1.2.2 消化炉设定温度的影响试验。控制不同设定温度，进行单因素试验，试验样品采用大豆粕。温度设置380、400、420、440、460 ℃ 5个梯度，设定空白试验（即不加大豆粕，其他试验条件相同）作为对照，根据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.3 消化炉消化时间的影响试验。控制不同消化时间进行单因素变量试验，设定消化时间分别为30、60、120、180、240、300 min 6个不同的温度，试验样品采用大豆粕，每个温度称取2组，再做2个空白组对照试验，其他试验条件保持不变，均采用GB/T6432—94中规定的试验条件，根据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.4 催化剂用量的影响试验。采用硫酸铜∶硫酸钾=1∶15的混合催化剂进行对比试验，试验样品采用大豆粕，分别设置3.4、4.4、5.4、6.4、7.4 g 5个不同量的催化剂用量，不同温度称取2组，再做2个空白组对照试验，其他试验条件保持不变，均采用GB/T6432—94中规定的试验条件，根据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.5 硼酸吸收液加碱的影响试验。配置不同的催化剂进行单一因素变量试验，根据GB/T6432—94中硼酸的配置方法进行配置，设2个处理，即1 000 mL硼酸吸收液中加入0.5 mL 4%氢氧化钠（A），硼酸吸收液中不加氢氧化钠（B），其他试验因素按照GB/T6432—94中规定的试验条件进行蒸馏滴定。并分别做了空白和回收率试验，每组试验做了3个平行试验。在试验中吸收液的酸碱度是否合适，可以通过以下方式进行简单的判断：移取10 mL硼酸吸收液，先加入100 mL蒸馏水，再加入几滴蛋白指示剂，如果指示剂变色，则说明酸度合适；如果仍然为红色，那么需要往硼酸吸收液中加适量的碱。硼酸的浓度对结果影响不大，均能够完全吸收氨气，因为硼酸是足够过量的。由于硼酸是一种酸性极弱的酸，所以pH值比较容易调节，而且容易与蒸馏出来的氨结合形成硼酸铵，利于用盐酸进行滴定，无其他化学反应的干扰。

1.2.6 蒸馏时间的影响试验。蒸馏时间设3、4、5、6、7 min 5个梯度，其他因素保持不变，试验具体操作根据GB/T6432—94中试验步骤进行的标准盐酸滴定溶液测定，根据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.7 盐酸浓度的影响试验。选用0.10、0.05、0.01 mol/L 3个浓度的标准盐酸滴定溶液和3种蛋白质含量不同的样品（鱼粉、大豆粕、玉米秸秆饲料）进行分组交叉试验，同时分别做空白对照试验，共12组平行试验。其他试验条件保持不变，均采用GB/T6432—94中规定的试验条件，根据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.3 数据计算endprint

设定3个平行试验，运用Excel对结果进行处理制表和绘图。

2 结果与分析

2.1 消化温度的影响

控制消化炉温度试验结果见图1。380、400 ℃的消化管中颜色为不透明的黑色，证明没有消化完全，而其他温度下的消化管均为蓝色透明。分析数据表明，消化温度以420 ℃效果最佳。

2.2 消化时间的影响

控制消化时间试验结果见图2。30 min消化出的样品为黑色，60 min为淡蓝色，其他时间消化出的样品均为蓝透明色。分析试验数据表明：在样品变绿后消化30 min蛋白质的含量偏低，随着消化时间的不断增大，蛋白含量逐渐增加，从2 h开始，蛋白质含量增加缓慢，消化2 h的蛋白质含量和消化5 h的蛋白含量没有显著差异，由此可见样品消化时间最好控制在样品变绿后2 h以上。

2.3 催化剂用量的影响

控制催化剂用量的单因素变量试验结果见图3。催化剂用量为3.4、4.4 g的试验组消化完的样品颜色均为黑色，催化剂用量为6.4 g的试验组为蓝色透明色，催化剂用量为7.4 g的试验组样品消化管内壁有黑色渣子。通过试验数据表明，在催化剂用量6.4 g的情况下消化最为完全准确，催化剂用量过多会造成消化管内壁有黑色残渣，催化剂用量太少导致消化不完全，均对结果有不利影响。

2.4 硼酸吸收液是否加碱的影响

通过控制硼酸吸收液是否加碱用量，探究硼酸吸收液是否加碱对试验结果的影响，分析数据见表1。可以看出，试验中硼酸吸收液中加入适量的碱，会导致空白值增大。但是对测定结果影响并不大，因为硼酸吸收液酸碱度对饲料样品和空白对照组的作用是一致的，这样就可以将影响抵消。

2.5 蒸馏时间的影响

对蒸馏时间进行控制的单因素变量试验结果见图4。通过试验数据表明，蒸馏时间在5 min之后，消化管中的游离氨全部被蒸馏出来，被硼酸吸收。3～4 min时未蒸馏完全；5～7 min都在允差范围内，表明蒸馏完全；但是在7 min时，蒸馏液已经超过了锥形瓶的2/3，不利于进行滴定试验。

2.6 盐酸浓度的影响

对鱼粉、豆粕、秸秆饲料3个样品分别用3种不同浓度盐酸进行滴定的结果见图5～7。通过分析，鱼粉组在3种盐酸浓度中浓度大小与误差的大小成正相关关系，即盐酸的浓度越小，对测定的结果差异越大。而玉米秸秆饲料组的数据也与盐酸的浓度成一定的规律（仅限这3种浓度下），即盐酸浓度越大，其平行数据间的误差越大，标准差较大。经过试验统计，每种样品盐酸滴定的平均消耗用量见表2。通过以上数据表格分析，盐酸在滴定量小于5 mL或者大于40 mL时，滴定误差比较大，蛋白含量较高时适合用高浓度酸滴定，蛋白含量较低时适合用低浓度的盐酸滴定溶液更准确。

3 结论与讨论

消化温度会影响消化的完全程度，从而影响测定粗蛋白的试验结果，温度小于420 ℃会导致数据偏小，温度过高导致蛋白质变性，氨类物质散失，也会导致数据偏小，造成试验误差。消化时间的长短就比较容易控制，只要消化时间达到2 h，消化就可以反应完全，而超过2 h，试验数据表明，粗蛋白的含量没有显著增加或减少，因此建议达到2 h。催化剂用量在6.4 g最为准确，过少导致消化不完全，过多会导致消化管产生黑残渣；而硼酸对于粗蛋白测定结果的影响较小，在调节pH值加入碱后，试验滴定空白更加明显，有利于颜色判断；蒸馏时间在5 min之后蒸馏完全；盐酸的浓度选择则需要根据试样的大体粗蛋白含量进行选择，通过对影响粗蛋白测定的每个因素进行单因素变量试验的分析，对粗蛋白测定结果影响最大的是消化阶段，而影响消化效果的因素主要为消化温度、消化时间、催化剂用量。

4 参考文献

[1] 李成会，朱莲英.不同消化方法对饲料中粗蛋白质测定值的影响[J].江西饲料，2006（2）：25-26.

[2] 朱莲英，邰秀林.温度、水分对贮藏中配合饲料蛋白质的影响[J].饲料工业，2005（5）：46-48.

[3] 李兴芳，王士长，李广平.粗蛋白不同测定方法的比较[J]饲料工业，2003（8）：37-38.

[4] 程彦伟，李培睿，李宗义，等.饲料粗蛋白含量分析方法比较[J].饲料工业，2001（11）：36-37.

[5] 龙翔，邰秀林.温度、水分对贮藏中配合饲料蛋白质的影响[J].饲料工业，2005（5）：46-48.

[6] 路苹，于同泉，王淑英，等.蛋白质测定方法评价[J].北京农学院学报，2006（2）：69-73.

[7] 饲料中粗蛋白测定方法：GB/T 6432-1994 [S].北京：中国标准出版社，1994.endprint