五种离子交换树脂对谷胱甘肽分离纯化的研究

赵红玲，高 杨，杨晓婧，尹志峰，王良友

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

五种离子交换树脂对谷胱甘肽分离纯化的研究

赵红玲，高 杨，杨晓婧，尹志峰，王良友

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

还原型谷胱甘肽；树脂；分离

谷胱甘肽是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，以还原态（GSH）和氧化态（GSSG）两种形态存在［1］。GSH有多种生理功能，对维持生物体内适宜的氧化还原环境尤为重要。临床用于中毒和感染性肝炎的治疗［2］。国内的需求都依靠进口，实现GSH的国产化，对于我国医药工业、临床医学和食品工业均有重大的社会效益和经济效益［3］。

本研究利用高产菌株发酵抽提液，对2种阳离子交换树脂（001X7、HZ-011），2种大孔强酸性阳离子交换树脂（D001、HD-81），1种大孔弱酸性阳离子交换树脂（D113）进行广泛筛选，确定出用于分离GSH选择性高，吸附量大的树脂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料：酵母菌（实验室筛选GSH高产菌株ZL136）；离子交换树脂（华东理工大学华昌聚合物有限公司）。化学试剂：GSH标准品、ALLOXAN（四氧嘧啶），Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验仪器：BT01-100型兰格蠕动（保定兰格恒流泵有限公司）；8823-B紫外检测器（北京宾达英创科技有限公司）；恒温震荡培养箱SPH-100B（上海世平实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 测定方法：四氧嘧啶法（ALLOXAN试剂衍生化法）测定GSH含量［4-5］。

1.2.2 GSH抽提液的制备：将高产菌株ZL136发酵培养48h，4000r/min离心10min，弃去上清；用5倍去离子水洗涤菌泥，离心10min，重复2次；酵母泥称重，冷冻。将预冻的酵母泥按照质量比1：5加入去离子水，混匀；80℃水浴加热10min，浓盐酸调整pH值3.0，4000r/min离心10min，上清液即为GSH抽提液，四氧嘧啶测定GSH含量。

1.2.3 实验：取预处理好的湿树脂5g和GSH提取液100ml，置于250ml的锥形瓶中。20℃下恒温振荡，直至吸附平衡为止，测定平衡后上清液中GSH的浓度，按下列公式计算树脂的吸附容量Q［6］：

C0：起始抽提液中GSH的浓度（mg/ml）；C*：平衡后抽提液中GSH的浓度（mg/ml）；V：抽提液体积（ml）；W：湿树脂质量（g）；Q：树脂吸附容量（mg/g）

2 结果与分析

2.1 四氧嘧啶法测定标准曲线 结果见图1：

图1 四氧嘧啶法测定GSH标准曲线

2.2 时间对吸附量的影响 结果见图2：

图2 不同树脂吸附时间曲线

通过树脂对GSH抽提液吸附时间实验可知：树脂吸附120min就可以基本达到吸附平衡；D113对于GSH吸附容量最小；001X7、D001的吸附容量高于HD-81、HZ-011。因此，对001X7、D001继续进一步比较。

2.3 pH对吸附量的影响 选择吸附较好的两种树脂001X7和D001，进行不同pH抽提液的吸附实验，每隔30min测定一次吸附容量。结果见图3、图4：

图3 001x7不同pH吸附时间曲线

图4 D001不同pH值吸附时间曲线

从以上两种类型的树脂在不同pH条件下的吸附量可知：两种树脂均在120min达到吸附平衡。001X7阳离子交换树脂的吸附量pH3＞pH4＞pH5，随着时间的延长，吸附量增加（见图3），从3.32mg/ml增加到3.57mg/ml。D001大孔阳离子交换树脂吸附量是pH5＞pH4＞pH3，随着时间的延长，交换量增加（见图4），从2.12mg/ml增加到2.73mg/ml。在pH3时001X7吸附量较高。

2.4 GSH浓度对吸附量的影响 选择吸附量最高的001X7树酯，进行不同GSH浓度对吸附量的实验，吸附120min平衡后，测定吸附量。结果见图5：

图5 001x7不同GSH浓度吸附量曲线

从图5可知，随着GSH浓度提高，001x7树脂的吸附量也是增加的，当GSH浓度大于150mg/L，001x7树酯的吸附量趋于平衡，达到了饱和吸附。

3 结论

通过三个类型的5种树脂吸附时间实验得出，树脂吸附120min就可以基本达到吸附平衡，001X7、D001的吸附容量较大；001X7、D001树脂在不同pH条件下比较，001X7树脂pH3吸附量较高，达到3.57mg/g；随着GSH浓度提高，001X7树脂的吸附量也是增加的，但是当GSH浓度大于150mg/L，001X7树酯的吸附量趋于平衡，说明达到了饱和吸附。静态吸附数据可为001X7离子交换树脂动态分离纯化的条件优化提供参考。

［1］Spector D， Labarre J， Toledano MB. A genetic investigation of the essential role of glutathione［J］. J Biol Chem， 2001， 276（10）：7011-7016.

［2］顾取良，吴梧桐.谷胱甘肽药理和临床研究新进展［J］. 药物生物技术，2001，8（1）：47-50.

［3］王大慧，卫功元.谷胱甘肽的应用前景及生产研究现状［J］.化学与生物工程，2004，21（3）：10-12.

［4］陈龙，袁宏丽，陈栋梁，等.发酵液中谷胱甘肽含量测定方法的比较［J］.理化检验（化学分册），2010，46（8）：876-878.

［5］刘娟，王雅琴，刘刚，等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较［J］.北京化工大学学报，2004，31（3）：35-38.

［6］常秀莲，丛丽华，刘建明，等.七种离子交换树脂分离谷胱甘肽的比较研究［J］.食品科技，2008，33（12）：208-210.

（技术方法栏目编辑：张 健）

TQ425.23

A

1004-6879（2015）03-0234-03

2014-11-17）