叶酸对胚胎大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响

李运书，孟祥硕，崔 策，严美悦，王春艳☒

（1.承德医学院2012级麻醉本科，河北承德 067000；2.承德医学院2011级麻醉本科；3.承德医学院2012级中西医临床本科；4.指导教师）

叶酸对胚胎大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响

李运书1，孟祥硕2，崔 策1，严美悦3，王春艳4☒

（1.承德医学院2012级麻醉本科，河北承德 067000；2.承德医学院2011级麻醉本科；3.承德医学院2012级中西医临床本科；4.指导教师）

叶酸；胚胎；大鼠；心肌；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

先天性心脏病发病率约为4.05%-12.30%，是我国城市0-5岁婴幼儿死亡的首要原因［1］。叶酸应用于预防心脏畸形始于20世纪90年代，但其作用机制尚未明确［2］。细胞凋亡是与增殖相反的细胞活动，胚胎细胞适度和适量的凋亡是器官外形正常建立的基础。本研究给予孕鼠叶酸干预，观察对胎鼠心肌细胞凋亡率、Bax、Bcl-2表达的影响，探讨叶酸对胎鼠心脏发生、发育过程中细胞凋亡的作用，为叶酸预防先天性心脏畸形的机制及安全剂量研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、分组、给药 10周龄健康清洁级SD大鼠，体重210-250g（北京大学医学部动物中心提供）。动物室室温为22±2℃，湿度45±5%，普通饲料喂养，自由摄水。大鼠随机分为小、中、大剂量叶酸组和对照组，每组10只。适应性喂养1周后， 按雌雄2：1比例合笼，次晨查阴栓，阳性者即确定受孕。从受孕日起，大、中、小剂量叶酸组分别灌胃给予叶酸（上海生物化学制品厂）2mg/kg/d、1mg/kg/d、0.5mg/kg/d。对照组灌服等量生理盐水。

1.2 取材及制片 各组孕鼠均于ED13.5处死，每只孕鼠随机取2只胎鼠的心脏，常规固定包埋，连续切片。每隔10张取7张（1套），每1心脏取10套，裱贴于APES载物片上，待染。

1.3 染色 免疫组化染色采用SP法，经过抗原修复、滴加一抗、二抗、三抗，DAB显色，苏木素复染。Mivnt显微图像分析系统对切片阳性物质进行定量分析。

1.4 TUNEL末端标记法 切片常规脱蜡至水、消除内源性过氧化物酶、加入新鲜配制的TUNEL反应液，DAB显色，苏木素复染。TUNEL凋亡检测试剂盒、Bax、Bcl-2一抗、免疫组化试剂盒均购自中杉金桥生物公司。

1.5 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件统计处理，叶酸干预影响采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎鼠心肌细胞凋亡率 各组胎鼠均可见凋亡阳性心肌细胞，其细胞核呈棕褐色。叶酸干预组细胞调亡率较对照组明显降低（P＜0.01）。不同剂量叶酸组间比较，大、中剂量组较小剂量组显著降低（P＜0.05）；大剂量组与中剂量组比较无明显差异（P＞0.05）（见附表）。结果提示，叶酸具有抑制胚胎心肌细胞凋亡的作用，且叶酸抗凋亡作用与剂量有关。

2.2 胎鼠心肌细胞Bax、Bcl-2的表达 Bax和Bcl-2在各组胎鼠心肌细胞均有表达，阳性物质呈棕黄色颗粒状，多位于细胞浆内，少数胞浆和胞核同时表达。叶酸干预组Bax表达明显低于对照组（P＜0.01）， Bcl-2表达显著高于对照组（P

＜0.05），提示叶酸能抑制Bax表达，提高Bcl-2的表达。不同剂量组间比较，大、中剂量组Bax和Bcl-2表达与小剂量组比较差异显著（P＜0.05）；大剂量组与中剂量组比较无明显差异（P＞0.05）（见附表）。不同剂量组表达量的不同，提示剂量大小与叶酸调节Bax、Bcl-2表达的作用程度有关。

附表 各组胎鼠心肌细胞凋亡率和Bax、Bcl-2表达（±s，n=10）

附表 各组胎鼠心肌细胞凋亡率和Bax、Bcl-2表达（±s，n=10）

与对照组比较：aP＜0.01，bP＜0.05；与小剂量组比较：cP＜0.05；与中剂量组比较：dP＞0.05

组别 凋亡率（%） Bax Bcl-2对照组 24.8±6.47 0.24±0.036 0.19±0.061小剂量组 16.19±3.03a0.18±0.045a0.26±0.044b中剂量组 11.13±3.83ac0.13±0.032ac0.37±0.035bc大剂量组 10.28±3.66acd0.11±0.027acd0.39±0.037bcd

3 讨论

细胞凋亡是解决胚胎器官发生、外形雕刻的重要细胞生物学事件。与增殖一样，胚胎细胞凋亡的发生时间、强弱在各种凋亡相关基因（如Bax、Bcl-2、P16等）的严格调控下进行［3］。目前认为，原癌基因Bcl-2是主要的抗凋亡基因，可以抑制多种转导途径的凋亡。Bax与Bcl-2功能完全相反，且是Bcl-2的拮抗基因， 通过编码相应功能蛋白起作用［4］。Bax与Bcl-2既能各自形成同源二聚体，又能互相作用形成异源二聚体，共同调节细胞凋亡。

本研究通过灌胃给予受孕大鼠不同剂量叶酸，发现叶酸明显降低了胎鼠心肌细胞Bax的表达、提高了Bcl-2的表达。结合TUNEL标记结果，叶酸干预组胎鼠心脏凋亡细胞率降低，共同提示叶酸可能通过调节Bax、Bcl-2两种凋亡调节基因的表达，进而降低胎鼠心肌细胞的凋亡。Bax、Bcl-2之间表达平衡的改变，可能是叶酸拮抗心肌细胞凋亡作用的分子机制之一。本研究结果与Wu等［5］一致，他们发现补充叶酸能显著减少STZ诱导的糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的发生。关涛等［6］学者在研究畸形发生机制时发现，应用PMX诱导实验动物发生NTD，其机制可能与PMX阻断了叶酸的代谢通路、导致神经上皮细胞过度凋亡有关，这与本研究结果一致。本研究还发现，随着叶酸浓度的增加，胎鼠心肌细胞凋亡率按对照组、小、中、大剂量叶酸干预组顺序呈逐渐下降趋势，提示剂量大小与叶酸调节心肌细胞凋亡的作用程度有关。

总之，叶酸可降低胎鼠心肌细胞促凋亡因子Bax的表达、提高抑凋亡因子Bcl-2的表达，并降低胎鼠心肌细胞的凋亡率。一定剂量范围内，叶酸下调Bax、上调Bcl-2表达及降低凋亡率的作用与剂量有关。叶酸预防畸形的作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡、调节凋亡基因的表达有关。

［1］吴明昌.先天性心脏病在围生期的评估［J］.中国医刊，2002，37（1）：4-6.

［2］杨江帆，杨戎威，李玮，等.叶酸预防先天性心脏病的作用［J］.中国新生儿科杂志，2007，2（3）：129-132

［3］于素香，孙玉国，王春艳.叶酸对妊娠大鼠胎盘细胞PCNA表达的影响［J］.承德医学院学报，2012，29（2）：128-130.

［4］Pickell L， Brown K， Li D， et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice［J］. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol， 2011，91（1）：8-19.

［5］Wu TG，Li WH，Lin ZQ，et a1.Effects of folic acid on cardiacmyocyte apoptos is in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Drug Ther.2008，22（4）：299-304.

［6］关涛，王秀伟，官臻，等.PMX诱导神经管畸形及其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响［J］.神经解剖学杂志，2011，27（4）：447-452.

（学生园地栏目编辑：张 健）

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1004-6879（2015）03-0259-03

2015-04-02）