小熊猫卵巢肥大细胞与雌性生殖干细胞的初步观察

刘聪

（中国农业大学，北京 100094）

小熊猫卵巢肥大细胞与雌性生殖干细胞的初步观察

刘聪

（中国农业大学，北京 100094）

肥大细胞分布于皮肤及内脏粘膜下的微血管周边，其与嗜碱性细胞结构和功能相似。此次研究中选取17只成体小熊猫卵巢进行研究，将其制成组织切片，并采用甲苯胺蓝进行染色，观察不同时期肥大细胞数量变化情况，研究结果显示，不同时期小熊猫卵巢肥大细胞数量对比存在显著差异，P＜0.05；采用免疫组化染色，卵巢中存在组胺阳性细胞，小鼠脉管同系物（MVH）在卵母细胞和生殖上皮中呈现阳性，说明小熊猫卵巢中有雌性生殖肝细胞存在，且肥大细胞与参与小熊猫生殖过程。

小熊猫；卵巢肥大细胞；雌性生殖干细胞

肥大细胞能分泌多种细胞因子，且能参与免疫过程，具有若吞噬功能。相关研究中对发情前期大鼠和仓鼠进行研究，研究结果显示，卵巢肥大细胞参与卵巢功能，在不同发情周期中数量不同差异性。而近年来，相关研究结果显示，成年哺乳动物卵巢中存在雌性生殖干细胞。因此此次研究中以成年小熊猫卵巢组织切片作为研究对象，研究肥大细胞与不同生理期之间的关系，总结小熊猫卵巢中肥大细胞雌性生殖干细胞之间的联系，为临床研究小熊猫生殖过程提供更多参考。现将具体研究内容进行报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物选取我市某动物园17只死亡雌性小熊猫作为研究对象，其死亡原因均为非生殖系统疾病。取小熊猫卵巢制成组织切片，包括5例发情期，6例妊娠期，6例发情期。

1.1.2 试剂使用试剂包括上海化学试剂厂生产的甲苯胺蓝、Alcian Blue 8GX（阿尔新蓝）、Safranine O（番红花红），上海古朵生物科技有限公司生产的鼠抗组胺抗体、兔抗小鼠IgG1、鼠抗MVH抗体。

1.2 方法

1.2.1 样品制作将小熊猫卵巢进行组织切片，形成1.5cm×1.5cm×0.5cm的组织切块，将组织切片放入福尔马林（40mL/L）中浸泡4h，保存温度为4℃。依据组织学技术制成半连续石蜡切片，厚度5μm。

1.2.2 染色将组织切片放于固定液，使用甲苯胺蓝进行染色。将石蜡切片脱蜡，呈水状后使用甲苯胺蓝浸泡，30s后使用双蒸水洗，水洗2次后使用乙醇（950mL/L）分色，使用显微镜观察，分色完成标准为肥大细胞出现紫红色颗粒。将分色完成的组织切片使用乙醇脱水，放入二甲苯，封片。进行AB-S脱色时，将切片进行脱蜡，使用pH1.42醋酸钠盐酸缓冲液（含3.6g/L阿尔新蓝8GX、0.18g/L番红花红O）染色，30min后经乙醇脱水，放入二甲苯，封片。

1.2.3 免疫组化染色将切片脱蜡，放入过氧化氢室（30mL/L）10min灭活，放入正常山羊血清（50mL/L）培养，30min后取出，放入pH7.0磷酸buffer液（鼠抗组胺抗体1:400/鼠抗MVH抗体、tritonX-100 0.2mL/L、bsat 0.1mL/L）孵育，保持4℃，使用PBS进行漂洗，室温下将兔抗小鼠IgG1孵育1h，室温下在过氧化物酶、生物素、抗生物素蛋白中孵育1h。使用PBS冲洗3次，使用苏木素再次染色，脱水后封片。

1.3 统计学方法

按不同生理期将切片分组，每只小熊猫取5张切片，在显微镜下对切片观察5个视野，取平均数。使用SPSS18.0软件进行单因素分析处理，计量数据采用均数±标准差（±s）表示正态计量数据的组间比较采用t检验。当P＜0.05时表示有显著差异，有统计学意义。

2 结果

发情期肥大细胞数为（11.1±0.5）个，妊娠期为（4.1±0.4）个，发情期为（8.4±0.3）个，发情期肥大细胞数与发情期相比明显较多，t=11.109，差异具备统计学意义，P＜0.05。发情期肥大细胞数与妊娠期相比明显较多，t=21.066，差异具备统计学意义，P＜0.05。经AB-S染色后可将其分为结缔组织型、黏膜型、混合型。经免疫组化染色后，组胺阳性细胞在发情期时数量多，在妊娠期时数量较少，但细胞形态较大，在发情期时数量少，形态较小。小鼠脉管同系物（MVH）在卵母细胞中呈阳性，且在生殖上皮中也呈阳性。

3 讨论

肥大细胞是嗜碱性细胞在结缔组织或粘膜中存在的一种形态，其来源于造血干细胞，能参与MHC分子、B7分子表达具备APC功能；与嗜碱性细胞相同，肥大细胞具有强嗜碱性颗粒，其中含有肝素、组胺等物质，能引起速发过敏反应。

肥大细胞是组胺重要来源之一，因此其能参与内分泌腺活动。研究结果显示发情期肥大细胞数与发情期相比明显较多，发情期肥大细胞数与妊娠期相比明显较多，P＜0.05。相关研究证明肥大细胞脱颗粒作用与排卵过程存在联系，当排卵开始时，肥大细胞数将显著减少。肥大细胞从发情期开始脱颗粒，数量显著增加，随生殖期变化，肥大细胞减少，脱颗粒及组胺也随之减少，因此可以得出肥大细胞参与小熊猫生殖过程，在小熊猫生殖期中起一定调节作用。经免疫组化染色后，在卵母细胞和生殖上皮中均发现雌性生殖干细胞，以往认为哺乳动物出生后卵母细胞不再生，这种理论对不育现象治疗产生极大阻碍。此次研究结果与成年雄性哺乳动物精元干细胞产生精子时期研究的相似。其证明了哺乳动物出生后能生成新的卵母细胞，成年雄性哺乳动物整个生命周期中精元干细胞均能产生精子和此次研究中成年小熊猫卵巢中雌性生殖干细胞的存在为小熊猫的繁殖过程提供了更多理论参考。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．11.010

刘聪（1992～），河北省衡水市人，本科，研究方向：动物医学