硝态氮含量对烟叶高温贮藏过程中TSNA形成的影响

孙榅淑，王俊，周骏，马雁军，白若石，杨惠娟，许东亚，焦哲恒，史宏志

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024

硝态氮含量对烟叶高温贮藏过程中TSNA形成的影响

孙榅淑1，王俊1，周骏2，马雁军2，白若石2，杨惠娟1，许东亚1，焦哲恒1，史宏志

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024

为研究硝态氮含量对调制后烟叶高温贮藏过程中TSNA形成的影响，设计白肋烟田间施氮肥量试验、室内对烤烟烟叶添加不同浓度硝酸盐试验，并对白肋烟和烤烟的叶片和烟梗分别取样，得到硝态氮含量差异较大样品。将样品在高温（45℃）条件下贮藏15 d，以在低温（10℃）条件下贮藏作为对照，测定所有样品的硝态氮和TSNA含量。结果表明：烟叶中硝态氮含量与施氮量呈正相关；新调制的烟叶硝态氮含量与TSNAs相关性较小，在高温贮藏15 d后，其相关性显著增加，烟叶硝态氮含量与高温贮藏期间TSNAs的增加量呈显著正相关；白肋烟和烤烟均表现出烟叶主脉中的硝态氮含量远高于叶片，高温贮藏15 d后，主脉TSNA增加量显著高于叶片；在人工添加硝酸盐的试验中，随添加硝酸盐量的增加，烤烟烟叶硝态氮含量及高温贮藏后TSNA含量显著增加。以上说明硝态氮含量与高温贮藏过程中TSNAs的形成有密切关系，通过农业措施降低烟叶硝态氮积累是减少贮藏过程中TSNA形成的有效途径。

烟草；硝态氮；TSNAs；高温；贮藏

烟草特有亚硝胺( Tobacco Speci fi c N-nitrosamines,TSNAs )是由烟草生物碱发生亚硝化作用生成的存在于烟叶和烟气中的有害成分。有关TSNAs的致病机制在国内外已有大量报道，其有害性在动物实验中得到证实[1-2]。目前已鉴定出烟草中8种特有的亚硝胺[3]。其中，在烟叶和烟气中含量较高且在近年来研究较多的烟草特有亚硝胺有4种：N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)[4]。许多研究表明，进入调制前的鲜烟不含TSNAs或含量极低[5-6]，烟叶中的TSNAs主要在调制和贮藏过程中形成和积累，但目前研究多集中在烟叶调制期间TSNAs的形成。Burton[7]和Cui[8]等的研究表明，白肋烟和晾晒烟的TSNAs快速增长发生在调制过程烟叶的变黄末期，在调制的第4到第7周含量大幅提高。

白肋烟调制结束后的贮藏阶段也是TSNA形成的重要时期，烟叶贮藏阶段其TSNA含量比调制结束可提高50%以上。De Roton等[9]报道贮藏在环境温度下的白肋烟粉碎样品，6个月后TSNA含量由1.3～1.4 μg/g增加到8.1～9.5 μg/g，而贮藏在冰箱里的样品TSNA含量没有显著增加。Saito等[10]也报道随着温度的增加，白肋烟贮藏烟叶TSNA含量和氮氧化物含量大幅增高。前期研究表明，不同类型烟叶贮藏过程中TSNA形成和积累有显著差异，在高温贮藏过程中，硝态氮含量较高的白肋烟TSNA形成量远大于含量低的烤烟[11]，为进一步研究烟草硝态氮含量对高温贮藏过程中TSNA形成的影响，设置了白肋烟不同施氮量田间试验，以获得不同硝态氮含量的白肋烟。在另一个试验中，通过向烤烟烟叶中人为添加不同浓度的硝酸盐，得到不同硝态氮含量的烤烟烟叶。将样品进行高温贮藏以研究硝态氮与贮藏过程中TSNA形成的关系。烟叶的叶片和烟梗在化学组成上差异很大，与调制后烟叶的叶片相比，叶梗的香气物质、生物碱含量较低，但硝态氮含量和TSNA积累量显著高于叶片。试验中还以硝态氮和生物碱含量差异较大的烟叶叶片和烟梗为材料在高温下贮藏研究其TSNA形成的差异性。该研究旨在揭示贮藏过程中烟草特有亚硝胺形成机理，为通过农艺和控制贮藏环境减少和抑制TSNA形成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 地点和材料

白肋烟样品的产地为云南宾川，品种为TN86，烤烟样品的产地为河南许昌，品种为中烟100，所取样品均为上二棚烟叶。

1.2 试验方法

1.2.1 不同施氮量水平的白肋烟样品

在云南宾川白肋烟产区进行田间试验，土壤为壤土，中等肥力，土壤pH为6.23，有机质含量为22.8 g/kg，碱解氮含量为50.2 mg/kg，速效磷含量为12.4 mg/kg，速效钾含量为54.1 mg/kg。试验共设四个施氮量，分别为：120，180，240，300 kg/hm2，其中75%的氮源为硝态氮。试验为随机区组设计，重复3次。

1.2.2 不同类型烟叶烟梗样品

白肋烟和烤烟分别取自云南宾川与河南许昌，栽培与调制按当地常规方式进行。分别以白肋烟和烤烟的烟叶和烟梗为供试材料，取样后，将叶片与叶梗分开，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.3 添加不同浓度硝酸钠的烤烟样品

以河南许昌烤烟烟叶为供试材料，将烟叶去除主脉后，剪成0.5 cm2大小的碎片，称取6份等量的20 g。其中5份待进行高温贮藏的烟叶分别均匀喷施10 mL浓度为0.00、0.01、0.02、0.03、0.04 g/mL的NaNO3溶液，另外1份待进行低温贮藏的烟叶喷10 mL蒸馏水。之后将烟叶置于10℃、RH 60%的恒温恒湿箱中平衡水分。

1.2.4 样品高温贮藏

将不同施氮量水平的白肋烟和不同类型烟叶烟梗的每个样品称取两份等量的20 g。一份置于恒定的45℃、RH 60%的恒温恒湿箱内处理15 d，一份置于恒定的10℃、RH 60%环境下贮藏15 d作为对照。将添加不同浓度硝酸钠溶液的烤烟置于45℃、RH 60%的恒温恒湿箱内处理15 d，低温对照置于恒定的10℃、RH 60%环境下贮藏15 d。之后将所有样品冷冻干燥，磨碎后过60目筛。

1.3 化学成分含量测定

1.3.1 硝态氮含量测定：烟叶样品送至美国肯塔基大学烟草化学分析实验室分析测定，采用比色法,具体参数按Burton等[12]方法进行。

1.3.2 TSNA含量测定：所有样品送至美国肯塔基大学和上海烟草集团北京卷烟厂进行重复测定，美国肯塔基大学测定方法为气相色谱-热能分析联用仪(TEA)，具体参数按Burton等[7,12]方法进行。北京卷烟厂测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPELC-MS/MS）法[13]，即将烟样全自动固相萃取，萃取液过水相滤膜后使用LC-MS/MS进行检测。

2 结果与分析

2.1 高温处理下不同施氮量白肋烟中TSNAs及硝态氮含量的变化

表1的结果表明，随着施氮量增加，产量有不同程度的增加，随着施肥量从120 kg/hm2增加到240 kg/hm2，产量从2085 kg/hm2增加到了3279 kg/hm2，施肥量继续增加时，产量的增加量减小。10℃贮藏15 d烟叶硝态氮含量随着施肥量和产量的增加而显著增加，TSNA含量随硝态氮增加而呈增加的趋势，但相关性较差。然而，在45℃条件下贮藏15 d的烟叶，随着硝态氮含量增加，TSNA含量显著增加，不同施氮肥量的烟叶与低温对照的差异均达到极显著水平，与对照相比TSNAs的净增加量随着硝态氮含量的增加而更多地增加，且呈显著高度正相关，相关系数达0.98。这一结果表明，烟草中的硝态氮水平与烟叶高温条件下贮藏过程中TSNAs的形成密切相关。

2.2 高温处理下不同类型烟叶烟梗中TSNAs及硝态氮含量的变化

表2结果表明，无论白肋烟还是烤烟，相同温度下烟梗的硝态氮含量都显著高于叶片。经过高温处理后，叶片和叶梗TSNA含量均显著增加，高温处理后的TSNA总量与低温对照相比差异均达到极显著水平。但叶梗中TSNAs的增加量显著高于叶片中的增加，其中白肋烟烟梗的TSNAs增加95.80%，而叶片增加106.66%；烤烟烟梗的差异更为明显，烤烟烟梗高温处理后增加367.05%，而叶片增加77.70%。

TSNAs的前体物为生物碱和硝酸盐，在对高温处理下不同类型烟叶烟梗中TSNAs及硝态氮含量变化的研究中，已知烟梗中的生物碱含量远低于烟叶中的含量，但硝态氮含量高于烟叶中的含量，高温处理后烟梗TSNA增加量显著大于叶片，说明烟梗中较高的硝态氮含量与贮藏过程中TSNA形成的关系密切。

表1 高温处理下不同施氮量烟叶TSNAs及硝态氮含量的变化Tab.1 Changes of TSNAs and nitrate nitrogen contents in tobacco leaves with different nitrogen applying amount under high temperature treatment µg·g-1

表2 高温处理下白肋烟和烤烟烟梗中TSNAs及硝态氮含量的变化Tab.2 Changes of TSNAs and nitrate nitrogen contents in lamina and midrib of burley and fl ue-cured tobacco under high temperature treatment µg·g-1

2.3 人工添加硝酸盐对烤烟贮藏过程中TSNA形成的影响

结果表明，随着人工添加硝酸盐量的增加，烟叶硝态氮含量显著增加。在高温贮藏条件下，烟 叶 NNK、NNN、NAT、NAB和 总 TSNA含 量均显著高于低温贮藏的对照样品，且与添加硝酸盐的量呈极显著的高度正相关，相关系数分别为0.96,0.94,0.99,0.98,0.97。表明烟叶硝态氮含量对高温贮藏中TSNAs的形成有重要影响。

图1 烤烟添加硝酸盐对高温处理下硝态氮和TSNA含量的影响Fig. 1 Effect of adding nitrate to fl ue-cured tobacco on nitric nitrogen and TSNA content under high-temperature treatment

3 讨论

烟草中硝态氮的积累与施肥、产量水平等密切相关，氮素作为烟草主要的营养元素，不仅在烟株的生长发育过程中起重要作用，也是硝酸盐、亚硝酸盐及生物碱形成和积累的重要来源。硝态氮与调制后烟叶TSNA形成有密切关系[14]，在烟叶调制期间，普遍认为TSNAs的形成主要是由于微生物的作用[15-17]，调制期间叶片表面的湿度与微生物活性在一定范围内呈线性关系。一般认为，在调制过程中, 烟草中的硝酸盐被微生物还原为亚硝酸盐以及氮氧化物(NOx),然后与烟草生物碱作用形成TSNAs[3,6,18-20]。本试验表明，在烟叶高温贮藏过程中，烟叶中的TSNA含量大量增加。在贮藏阶段，环境相对湿度为60%，烟叶的相对含水率为17%，烟叶表面相对湿度较小，微生物活性低，因此可以推断在这一阶段烟叶硝态氮含量和温度与TSNA含量的关系更为密切。王瑞云等[21]的研究发现不同类型烟草贮藏过程中 TSNA 形成对高温的反应差异较大，硝态氮含量低的烤烟在高温处理后TSNAs 增加不显著，而硝态氮含量高的白肋烟和晒烟增加幅度较大，因此认为可能与不同类型烟草硝态氮含量有密切关系。本研究通过设置田间施氮量试验和在室内人工添加硝酸盐试验，并分别对硝酸盐含量和生物碱含量差异较大的叶片和主脉取样，直接证明了烟叶硝态氮含量对高温贮藏过程中TSNAs的形成有重要影响，较高的硝态氮含量和高温互作可能是造成贮藏期间TSNA含量增高的主要原因。

TSNAs主要是在烟叶中形成的，在卷烟燃烧过程中，烟叶中的TSNAs可直接传输到烟气中，而燃烧过程本身形成的TSNAs较少[22]，因此降低烟气中的TSNAs应主要从减少烟叶中TSNAs的形成和积累入手。烟气中焦油含量与TSNA含量无显著相关性，因而通过工业措施降低焦油后，TSNA含量不一定同步下降，而通过农业措施降低烟叶中的TSNA含量有更大的可行性。根据本试验结果，控制和减少烟叶硝态氮积累对降低TSNAs有重要作用。硝态氮含量主要受氮肥种类及用量、土壤供肥特性、品种对氮素利用效率和利用模式等因素的综合影响，因此，采取积极措施，通过调整施肥量和肥料种类等方法降低烟叶硝态氮积累，减少亚硝化反应底物，是降低烟叶TSNA含量的一种重要途径。

4 结论

白肋烟硝态氮的积累随着施氮肥量的增加而增加，随着人工添加硝酸盐量的增加，烤烟烟叶硝态氮含量显著增加，白肋烟和烤烟均表现出叶脉中的硝态氮含量远高于叶片。3项试验结果均表明，随着烟草硝态氮含量的增大，高温贮藏过程中TSNA形成增多，烟叶硝态氮含量与高温贮藏期间TSNAs的增加量呈显著正相关。

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Effect of nitrate nitrogen level in tobacco leaves on TSNAs formation during high temperature storage

SUN Wenshu1, WANG Jun1, ZHOU Jun2, MA Yanjun2, BAI Ruoshi2, YANG Huijuan1, XU Dongya1, JIAO Zheheng1, SHI Hongzhi1
1 National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Tobacco Cultivation Key Laboratory of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China

Field experiment was conducted to determine the effect of nitrate nitrogen content on TSNAs formation during high temperature storage. Different concentration of nitrate was applied in tobacco growing season. Leaf samples from lamina and midrib of both burley and fl ue-cured tobacco were collected. Lab experiment was conducted in a temperature-controlled chamber at 45℃ and 10℃ for 15d. Nitrate nitrogen and TSNA contents of all samples were determined. Results indicated that nitrate nitrogen content increased with the increment of nitrogen fertilizer. Content of nitrate nitrogen and TNSA had a low correlation in newly cured tobacco. However, after high temperature storage for 15d, the correlation signi fi cantly increased. Nitrate nitrogen content and TSNAs increment during high temperature storage showed a signi fi cant positive correlation. Nitrate nitrogen content in midrib was much higher than that in lamina in both burley and fl uecured tobacco. After high temperature storage for 15d, TSNAs increment in midrib was significantly higher than that in lamina. With the increase of nitrate applied to fl ue-cured tobacco leaves, nitrate nitrogen and TSNA content after high temperature storage increased signi fi cantly. These results indicated that nitrate nitrogen content was closely related to the formation of TSNAs during high temperature storage. Therefore, reduction of leaf nitrate content through agronomic measures is effective in reducing TSNA formation during storage.

tobacco; nitrate nitrogen; tobacco-speci fi c nitrosamines; high temperature; storage

:SUN Wenshu, WANG Jun, ZHOU Jun, et al. Effect of nitrate nitrogen level in tobacco leaves on TSNAs formation during high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21 (2)

孙榅淑，王俊，周骏,等. 硝态氮含量对烟叶高温贮藏过程中TSNA形成的影响 [J]. 中国烟草学报，2015,21（2）

国家烟草专卖局减害重大专项项目：110201301022（JH-03）

孙榅淑(1990—)，在读硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究，Email：swssdd123@163.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生导师，主要从事烟草栽培生理研究，Email：shihongzhi88@163.com

2014-01-07