HPLC法测定清热暗疮丸中绿原酸的含量

岳 莉，戚继红，沈 伟

(安徽省淮北市食品药品检验中心，安徽淮北 235000)

清热暗疮丸是由金银花、大黄浸膏、穿心莲浸膏、人工牛黄、蒲公英浸膏、珍珠层粉、山豆根浸膏、甘草、栀子浸膏等九味中药制成的中药制剂，具有清热解毒，凉血散瘀，泻火通腑之功效，临床用于治疗痤疮(粉刺)，疖痛。该产品收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第六册，原标准没有有效成分的含量测定。金银花为其处方中君药之一，主要成分为绿原酸，具有抗菌、抗病毒活性。为了有效控制该产品的质量，经参考有关文献及《中国药典》2010年版一部［1］方法，本文采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸的含量，用于本制剂的质量控制。

1 仪器及试药

1.1 仪器 Thermo U-3000 HPLC色谱系统;ChromeleonTM7工作站;Thermo DAD-3000检测器;超声波处理器(济宁奥波超声电气有限公司，批号:JAC-300);Mettler AE-240电子分析天平(0.1 mg;0.01 mg)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110753-200413，供含量测定用);清热暗疮丸，来源:我所监督抽样样品(吉林省天光药业有限 公 司，批 号:20130201，20130204，20130307，20130312);乙腈、磷酸为色谱纯;甲醇为分析纯，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验［2－4］色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈—0.4%磷酸溶液(14∶86);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;进样量:10 μL;检测波长 327 nm［2］。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取绿原酸对照品12.78 mg，置50 mL棕色量瓶中，用适量50%乙醇溶解，超声，冷却定容，摇匀，即得浓度为255.6 mg·L-1的绿原酸对照品储备液。见图1。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20丸，研细，取细粉约0.54 g(相当于4丸的重量)，精密称定，置25 mL棕色量瓶中，加入50%乙醇适量，置超声仪中超声30 min，放冷至室温，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。见图2。

2.2.3 样品阴性对照溶液 按清热暗疮丸的处方，称取除金银花的粉末约0.54 g，按供试品制备方法制备阴性对照溶液。在供试品色谱图中，与对照品色谱相应的位置上有着相同保留时间的色谱峰，而阴性溶液在此保留时间无色谱峰出现，表明没有其它成分干扰峰。见图3。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察 分别精密量取对照品储备液0.5、1、4、10、20、30 mL 置 50 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，按上述色谱条件，精密吸取上述对照品溶液及储备液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品的峰面积(A)为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标(mg·L-1)，得绿原酸的线性回归方程为 Y=0.532 5X-0.077 71(r=0.999 99)，在 2.556 ～ 255.6 mg·L-1的范围内具有良好的线性关系。

2.3.2 检测限 按信噪比3∶1计，绿原酸的检出限为 0.051 mg·L-1。

2.3.3 专属性试验 精密吸取样品阴性对照溶液10μL，注入液相色谱仪，结果表明，阴性对照无干扰。

2.3.4 精密度试验 精密量取“2.2”项下10 mL对照品溶液，连续进样 5次，绿原酸的面积为27.079、27.051、27.037、27.129、27.039，RSD=0.039%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取样品测定项下的供试品溶液(批号:20130201)，分别在 0、2、4、6、8、10、12、14、18、30 h进样测试，记录色谱图，其峰面积的RSD为0.60%，提示在30 h内都可进行相对准确的定量分析。

2.3.6 重复性试验 取同一批号的样品(批号:20130201)6份，各测定2次，照样品测定项下方法测定，计算含量，绿原酸的平均含量为2.088 3 mg·g-1，RSD 为 0.69%，结果表明方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(批号:20130204)，置25 mL棕色量瓶中，共9份，分成3组，每组分别精密加入含绿原酸51.12 mg·L-1对照品溶液液 4、5、6 mL，照“2.2.2”制备方法得加样回收率试验溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果绿原酸平均回收率为99.8%，RSD=0.82%。结果见表1。

表1 绿原酸加样回收率

2.4 样品的测定 取本品3批(批号:20130201，20130307，20130312)，各取2份，精密称取适量，置25 mL棕色量瓶中，照“2.2.2”制备方法得供试品溶液。精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)，用回归方程计算含量，结果见表2。

表2 绿原酸样品测定结果

3 讨论

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。由于绿原酸的特殊结构，决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来，但是由于绿原酸本身的不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热。绿原酸的供试液放置于棕色瓶、冰箱(2℃)保存时最为稳定。本文经过试验研究及参考相关资料，确定绿原酸的提取溶剂为50%甲醇，超声时间 30 min 最佳［5-6］。

因供试品含多组分物质，图谱中还有相关色谱峰，而绿原酸属于有机酸，在HPLC测定时易发生前沿或拖尾峰，流动相中加入酸可以改善峰形［7-9］。参考药典，通过调节流动相乙腈—0.4%磷酸的比例，绿原酸峰的保留时间约为8.0 min，所有成分全部出峰时间为35 min，柱效高，峰形好，绿原酸与其它相邻的色谱峰达到完全分离。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:205-206.

［2］许 永，吕晓燕.HPLC法测定清痤颗粒中绿原酸的含量［J］.安徽医药，2012，16(3):316-317.

［3］刘英慧，雷 鹏，朱 露，等.RP-HPLC法同时测定甘松中绿原酸和蒙花苷的含量［J］.中国新药与临床药理，2012，23(3):318-321.

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［5］李树鹏，刘凤鸣，刘 永.忍贝颗粒质量标准的研究［J］.淮海医药，2012，30(4):351-353.

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［7］高 茹，林以宁，梁 歌，等.绿原酸的吸收与代谢研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(10):316-319.

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［9］孙艳涛，王 冰，李云兴，等.金银花-连翘药对中绿原酸和连翘苷在大鼠各组织中的分布研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(17):157-160.