猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较

吴秀娟，李凯航，杨显超，王 建

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较

吴秀娟，李凯航，杨显超，王 建

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

[目的]比较猪瘟病毒（CSFV）5种ELISA抗体检测试剂盒的使用效果。[方法]利用细胞中和试验制备的标准质控血清，制备不同猪瘟抗体效价的阳性血清70份和阴性血清20份，对5种试剂盒的敏感性、特异性和符合率进行比较。利用该5种试剂盒对不同年龄段猪群血清中猪瘟抗体水平进行检测。[结果] 5种试剂盒的敏感性为85.7%-100%，特异性均达到100%，符合率为88.9%-100%。不同年龄段猪血清样品中，5种试剂盒检测结果不尽相同。[结论]猪瘟抗体效价的高低对5种试剂盒检测结果的一致性有一定影响，尤其是针对弱阳性样品时，IDEXX猪瘟抗体试剂盒和荷兰赛迪公司的猪瘟抗体试剂盒检测效果相对较好，为猪瘟免疫检测工作提供了一定依据。

猪瘟病毒；抗体检测试剂盒；比较和应用

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、具有高度传染性和致死性的猪传染病，在许多国家和地区均有发生，给畜牧生产造成了严重的经济损失[1]。世界动物卫生组织（OIE）将猪瘟列为法定通报性疾病，我国将其划为一类动物传染病，并纳入重大动物疫病防控计划。疫苗预防接种是控制该病的有效措施，并取得了良好效果。随着CSFV疫苗的应用，需要评价疫苗接种的免疫效果。目前，用于检测CSFV抗体的方法主要包括细胞中和试验，是国际公认的CSFV抗体检测的经典方法[2-3]，但该方法的敏感度和准确性易受人员、试剂等诸多因素的影响，多限于实验室使用。临床检测中主要采用CSFV-ELISA抗体检测试剂盒，但不同品牌试剂盒的检测效果存在差异。因此，本研究以细胞中和实验获得的阴性、阳性血清参考品制备标准阴阳性血清样品，针对5种CSFV-ELISA抗体检测试剂盒的敏感性、特异性以及符合率进行了比较。为临床中CSFV疫苗免疫评价和流行病学

调查提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 抗体检测试剂盒

5种试剂盒编号为试剂盒A、B、C、D、E，猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒（批号140401）为中国兽医药品监察所产品；ID Screen Classical Swine Fever E2 Competition ELISA kit（批号626）购自上海典诺生物有限公司；IDEXX Classical Swine Fever Virus （批号 B801）购自上海赛嘉生物有限公司；BioChek Classical Swine Fever Virus（CSFV-E2） Antibody Test kit （ 批 号Fs5655）购自上海赞维生物有限公司；PrioCHECK CSFV Antibody ELISA Test kit （批号 N140501L） 购自荷兰赛迪公司。试剂盒A样品IE值=样品OD450 /标准品阳性对照平均值OD450×100%，其值大于或等于10%时，判定为猪瘟抗体阳性。试剂盒B样品S/N%值=样品OD450 /标准品阴性对照平均值OD450×100%，其值小于或等于50%，判定为猪瘟抗体阳性。试剂盒C样品Blocking%值=（标准品阴性对照平均值OD450－样品OD450）/标准品阴性对照平均值OD450，其值大于或等于40%，就判定为猪瘟抗体阳性。试剂盒D样品S/P值=（样品OD值－阴性对照平均OD值）/（阳性对照平均OD值－阴性对照平均OD值），其值大于或等于0.5，就判定为猪瘟抗体阳性。试剂盒E样品PI值=（1－样品OD450 / 标准品阴性对照平均值OD450）×100%，其值大于或等于40%，就判定为猪瘟抗体阳性。

1.2 标准阴性和阳性血清

猪瘟病毒阴性和阳性血清（细胞中和试验）参考品购自中国兽医药品监察所。阴性血清批号为S0760905-1。阳性血清批号为S0760905-3，其标定定值的细胞中和效价分别为1:（2138±2）。通过对参考品进行稀释，共获得20份标准阴性血清，70份标准阳性血清，阳性血清中猪瘟抗体的效价为1:1000，1:500和 1:250的强阳性血清各10份；1:100， 1:50和1:25的中等阳性血清各10份；1：10的弱阳性血清10份。制备的标准血清样品用于ELISA抗体检测试剂盒的评价。

1.3 试剂盒的敏感性、特异性和符合率

采用制备好的标准血清对5种猪瘟抗体ELISA检测试剂盒进行检测评价，按下列公式计算各试剂盒的敏感性、特异性和符合率。敏感性=（检测为阳性的血清份数/标准阳性血清总份数）×100%；特异性=（检测为阴性的血清份数/标准阴性血清总份数）×100%；符合率=（检测为阳性和阴性的血清份数/标准血清总份数）×100%。

1.4 不同年龄段猪血清样品

收集15d、30d、50d、70d、90d、120d、150d和180d日龄猪群的血清样品各10份，实验仔猪于25～30日龄完成猪瘟疫苗的首免。血清样品由本实验室保存备用。

2 结果

2.1 5种ELISA试剂盒的敏感性、特异性和符合率的比较

采用制备好的标准阴性血清20份和标准阳性血清70份，对5种试剂盒平行检测，并计算各试剂盒的敏感性、特异性及符合率，结果见表1。敏感性方面，试剂盒C和E的敏感性最好，都达到了100%。试剂盒D的敏感性为98.6%，而试剂盒A和试剂盒B的敏感性为85.7%。特异性方面，5种试剂盒的特异性都达到100%。符合率方面，试剂盒C和试剂盒E符合率达到100%，试剂盒A和B符合率为88.9%，试剂盒D符合率为98.9%。以上结果表明，这5种试剂盒在敏感性，特异性和符合率上相差并不大，其中试剂盒C和试剂盒E的检测结果相对较好。

2.2 5种ELISA试剂盒的检测结果和猪瘟抗体效价相关性研究

表1 5种试剂盒的敏感性、特异性及符合率比较

通过对细胞中和实验得到的阴性、阳性血清参考品进行稀释，得到的标准阳性血清中猪瘟抗体效价为1:1000，1:500，1:250，1:100，1:50，1:25和1：10。不同猪瘟抗体效价的阳性血清样品各10份，利用5种试剂盒进行平行检测，结果见表2。

由检测数据发现，随着猪瘟抗体效价变化，5种试剂盒检测数据有趋势性变化。试剂盒A和B检测临界值位于猪瘟抗体效价1:10到1:25之间。试剂盒C和E检测临界值小于猪瘟抗体效价1:10。试剂盒D检测临界值位于猪瘟抗体效价1:10附近。

由此推断，试剂盒C和试剂盒E在检测猪瘟抗体效价达到1:10的样品时，其敏感性已达到100%，而试剂盒A、B和D在检测猪瘟抗体效价达到1:25的样品时，其敏感性才达到100%。可见，试剂盒C和E的检测精确度较好。

在猪瘟效价为1:10的弱阳性血清样品的检测中，5种检测试剂盒的检测结果见表3。试剂盒C和E的检测结果为100%阳性，试剂盒D的检测结果为90%阳性，试剂盒B的检测结果为100%阴性，而试剂盒A 的检测结果为70%阴性，30%可疑。由此可见，在弱阳性样品情况下，5种试剂盒检测结果有一定的差距。

2.3 不同年龄段猪群猪瘟抗体的检测

采自15d、30d、50d、70d、90d、120d、150d和180d日龄不同年龄段猪群的血清样品，各10份，利用5种试剂盒进行平行检测，可疑结果计算为阴性结果，检测结果见表4。15日龄猪群的10份血清样品，5种试剂盒检测阳性率在40%～90%之间。30日龄猪群的10份血清样品，5种试剂盒检测阳性率在20%～60%之间。50日龄猪群的10份血清样品，5种试剂盒检测阳性率在50%～100%之间。70、90、120、150日龄猪群的10份血清样品，5种试剂盒检测阳性率均在100%之间。180日龄猪群的10份血清样品，5种试剂盒检测的阳性率在70%～90%之间。由此可见，在不同年龄段猪群血清中，5种试剂盒的检测结果有所不同，尤其是在15、30、50日龄的猪群血清中。

3 讨论

本研究对5种猪瘟抗体ELISA检测试剂盒进行比较显示，它们总体在敏感性、特异性以及符合率上相差并不大，其中试剂盒C和试剂盒E敏感性和符合率达到100%，检测结果相对较好。根据检测结果和猪瘟抗体效价相关性研究发现，5种试剂盒的检测临界值有所差异。在血清样品为弱阳性，猪瘟抗体效价较低的情况下，5种试剂盒的敏感性和符合率上也不相同，试剂盒C和E的敏感度和精确度更高。究其原因可能如下：试剂盒A、B、D和E都是采用重组表达的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原包被ELISA板，但所使用的酶标二抗有所不同。试剂盒A、B和D都是采用的兔抗猪IgG的多抗，利用间接ELISA的方法进行检测。而试

剂盒E采用的针对E2蛋白的单克隆抗体，利用阻断ELISA的方法进行检测，由于单克隆抗体的特异性强，纯度高，均一性好等优点会使得试剂盒E在敏感性和符合率更好[4]。而试剂盒C是以猪瘟病毒抗原包被ELISA板，用阻断ELISA原理检测猪瘟病毒抗体，其所采用的二抗是抗猪瘟病毒的单克隆抗体，其二抗和包被抗原的结合特异性和敏感性都能够得到保证。此外，5种试剂盒的判定标准也有所不同，相较于A、B、和D试剂盒，试剂盒C和E判定阳性的临界值所对应的猪瘟抗体浓度更低。综上所述，在血清样品中猪瘟抗体效价低于一定量的时候，试剂盒C和E的检测效果优于其他试剂盒，但这两个试剂盒之间的差异还需要进一步实验的证明。

表2 5种试剂盒检测结果和猪瘟抗体效价相关性研究

表3 5种试剂盒检测猪瘟抗体效价为1:10血清样品的检测结果

表4 不同年龄段猪群猪瘟抗体5种试剂盒检测结果

有相关实验表明，猪瘟的母源抗体在32日龄会下降到50%左右，而上海地区一般给25-30日龄仔猪进行猪瘟首次免疫[5]。因此在50日龄前，仔猪体内主要为母源抗体，其血清中猪瘟抗体效价不会很高，所以在本研究中，5种试剂盒在15、30和50日龄猪群血清样品中检测结果有所差异。等到猪群达到70-150日龄之间，猪群体内的猪瘟免疫抗体达到了一定的峰值并一直维持在较高水平，5种试剂盒的检测结果就均为100%。由此可见，5种试剂盒主要是在样品中猪瘟抗体效价不太高的时候，检测有所差异，等到样品中抗体效价达到一定水平后，其检测结果并无太大差异，提示我们实验室检测人员在检测猪瘟抗体位于阴阳性临界值的弱阳性样品时，要关注不同试剂盒检测结果可能存在差异，假阴性和假阳性的结果比例都有可能上升。本研究通过对不同猪瘟抗体ELISA检测试剂盒的比较，显示在高抗体效价情况下，5种试剂盒的检测结果无明显差距，但在低抗体效价情况下，基于阻断ELISA方法，利用针对包被抗原的特异性单克隆抗体的两种试剂盒检测效果优于其他试剂盒，更能够客观评价猪体血清的抗体水平，为今后猪瘟抗体检测提供一定的科学依据。

[1] Edwards S，Fukusho A，Lefevre P C，et al. Classical swine fever：the global situation [J]. Vet Microbiol，2000，73（2-3）：103-119

[2] OIE Biological Standards Commission．Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals（Mammals，Birds and Bees）．5th ed．Paris：Office International Des Epizooties，2004．

[3] 中华人民共和国农业部．中华人民共和国农业部公告（第1125号），2008．

[4] 徐璐，范学政，徐和敏，等.猪瘟间接ELISA方法的建立和优化[J].中国兽医杂志.2012.48（3）：15-17.

[5] 孙泉云，夏炉明，卢军，等.上海规模猪场主要猪病母源抗体消长动态的跟踪调查[J].畜禽业杂志. 2014.305（9）：60-61.

Comparison of 5 Antibody Detection Kits for Classical Swine Fever Virus

XiujuanWu，Kaihang Li，XianchaoYang，Jian Wang
（Shanghai animal disease control center，Shanghai 201103）

To compare 5 commercial ELISA kits for detection of CSFV sera antibody，a total of 70 samples of CSFV-positive sera at different antibody titers and 20 samples of CSFV-negative sera diluted with reference negative and positive sera against CSFV prepared via cell neutralization test were used in the tests. The results showed that the sensitivity，specifi city and coincidence rates were 85.7% to 100%，100%-100% and 88.9%-100% respectively in the 5 ELISA kits. In addition，the sera samples from different age pigs were used for the detection of the 5 ELISA kits. All the results showed that CSFV different antibody titers had some effects on the detection results of the 5 kits，especially for the weak positive samples，the detection results of the IDEXX CSFV antibody test kit and the PrioCheck CSFV antibody test kit were better.

classical swine fever virus；antibody detection kits；comparison and application

S852.651

B

1005-944X（2015）05-0078-04

沪农科推字（2012）第3-2号；沪农科产字（2015）第6号

王建