混合菌种发酵生产的低酸度川味香肠挥发性成分分析*

巩洋，孙霞，杨勇，张楠，郭艳婧，李诚，胡滨，何利

(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

川味香肠是我国特色的传统腌腊肉制品，其挥发性物质是一种重要的品质指标，对于川味香肠新产品的开发、标准化生产和质量控制有着重要的意义。发酵香肠的风味物质形成途径主要有碳水化合物的分解、脂肪氧化、蛋白质的降解，而微生物和环境条件(温度和相对湿度)会对风味物质的种类和含量产生影响［1-2］。

乳酸菌对香肠的风味形成起重要作用，其贡献主要来自于发酵碳水化合物产生的乙酸和乳酸，同时会产生某些挥发性风味物质［3］。Larrouture 等［4］研究发现，植物乳杆菌具有分解脂肪的能力，脂肪降解产物是发酵香肠挥发性成分的重要来源。Papamanoli等［5］从希腊干发酵香肠中分离的乳酸菌具有分解蛋白的能力，而某些蛋白降解产物是形成发酵香肠挥发性成分的前体物质。此外还有学者研究发现，自然发酵香肠中的某些葡萄球菌和微球菌也具有蛋白质降解能力，接种此类发酵剂可以提升发酵香肠的风味［6］。

本研究通过以植物乳杆菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作为发酵剂并在智能化控温控湿条件下生产低酸度川味香肠，利用顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱联用技术对其挥发性成分及其相对含量进行检测和分析，比较4组川味香肠挥发性成分及其相对含量的差异，为进一步研究低酸度的川味香肠风味物质的形成机理打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵菌种:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediocossus pentosaceus)、葡萄球菌(Staphylococcus)均由食品学院肉品研究室从传统四川香肠中分离得到［7-8］。新鲜猪后腿肉、肠衣、食盐、白砂糖等调味料购于当地农贸市场。

LHS-250SC型恒温恒湿培养箱，上海荣丰科学仪器有限公司;DHG29345A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒公司;PHS-3C型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;SW-GJ-IFD型超净工作台，苏净集团泰安公司;Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪［配有HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)］，美国安捷伦公司;萃取头 75 μm Carboxen PDMS萃取头，美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 川味发酵香肠的制作

本研究在单因素实验和正交实验等前期工作的基础上，确定了低酸度川味香肠(pH值为5.50)的工艺参数为:发酵温度20℃，发酵时间12 h，葡萄糖添加量0.10%，发酵相对湿度75%;成熟温度13℃，成熟时间4 d，成熟相对湿度60%。

实验分为4个处理，以字母A、B、C、D表示。A是接种1∶1∶1比例复合的植物乳杆菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作为发酵剂，通过智能化控温控湿生产的低酸度川味香肠;B是不接种发酵剂并在智能化控温控湿条件下生产的川味香肠;C是接种1∶1∶1比例复合的植物乳杆菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作为发酵剂，在自然条件下(环境温度为8～15℃，相对湿度为75%～90%)生产的川味香肠;D是不接种发酵剂，在自然条件下(环境温度为8～15℃，相对湿度为75%～90%)生产的传统川味香肠。

发酵液制备:将植物乳杆菌和戊糖片球菌接种到液体MRS培养基中，将葡萄球菌接种到液体MSA培养基中，在30℃条件下培养24 h，菌种活化2次，血球计数法计数，直至达到106CFU/g以上。

工艺流程:原料肉→预处理→绞碎→搅拌→接种→灌肠→发酵→成熟→干燥(55℃，24 h)→成品。

1.2.2 感官评价

采用感官评定之描述定量分析法(quantitative described analysis，QDA)［9］，邀请 10 名有品评经验的人员，分别从滋味(30分)、香气(30分)、色泽(25分)和外观(15分)进行评定，满分100分，评定标准见表 1［10］。

表1 川味香肠感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Sichuan-tppe sausage

1.2.3 挥发性物质检测

取绞碎的香肠样品5 g于15 mL顶空进样瓶中，封盖后在60℃水浴下加热30 min，将萃取头插入到顶空瓶中萃取30 min。取出萃取头插入到GC-MS仪气相色谱进样口，250℃条件下解析5 min。

讲座结束后，毕宏生与山东中医药大学附属眼科医院的专家们开展了义诊活动，为240余名机关干部职工和住地武警官兵作了眼健康体检。

1.2.4 GC-MS条件

色谱条件:HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm);载气为氦气，流速为1.0 mL/min;进样口温度250℃，初始温度35℃，保持3 min，然后以3.0℃/min升至140℃并保持1 min，再以10℃/min升至250℃，保持6 min。

质谱条件:电子源EI，电子能量70 eV，离子源温度230℃，GC-MS传输线温度280℃;溶剂延迟时间为1.5 min;扫描范围为50～550 amu。

1.2.5 挥发性成分的定性定量方法

检测的未知化合物通过NIST08.LIB标准谱库进行对比匹配，取匹配度大于800的鉴定结果，结合文献进行人工谱图解析，确定其化学成分，利用峰面积归一化方法计算相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 川味香肠的感官评价结果

对4种不同加工条件下的川味香肠进行感官评价，感官评价结果见表2。

表2 川味香肠感官评价结果Table 2 Sensory evaluation of Sichuan-style sausage

从表2中可以看出，4种川味香肠的感官评分结果从大到小依次是:A、C、D和B，即人工控温控湿并接种混合发酵剂生产的低酸度川味香肠的风味相对较好。

2.2 四种川味香肠主要挥发性成分检测结果

采用SPME-GC-MS法分析检测4种川味香肠的挥发性成分及相对含量见表3。

2.2.1 四种川味香肠的挥发性成分种类数量差异

4种川味香肠中共鉴定出挥发性成分80种，其中酯类10种，醇类8种，醛类7种，酮类7种，酸类5种，脂肪烃类37种，其他类物质6种。A、B、C、D四组川味香肠中分别鉴定出57种、41种、49种和49种挥发性风味成分。其中脂肪烃类和酯类物质的种类数在4种川味香肠中较丰富，但不同工艺条件下生产的川味香肠产品中风味物质的种类数及个体风味成分存在差异。

就个体风味成分而言，芳樟醇在4种川味香肠中含量均较高，相对含量均超过10%。除此之外，乙酸芳樟酯和右旋萜二烯在川味香肠中的相对含量也较高。A组(低酸度川味香肠)中含有相对含量较高的乙酸(1.35%)和十六酸(0.85%)，此外乙二酸、甲氧基乙酸和己酸为A组香肠所特有的风味成分。

表3 4种川味香肠中挥发性成分及相对含量测定结果Table 3 Volatile components and their relative contents four kinds of Sichuan-style sausage

续表3

2.2.2 四种川味香肠的主要挥发性风味物质相对含量差异

就醇类物质而言，川味香肠中醇类的来源比较广泛，其中大多来源于微生物碳水化合物的代谢，如乙醇;此外，还有一部分来源于脂肪氧化，如1-辛烯-3-醇，由于它阈值较低，因此对川味香肠的风味形成具有一定作用，这与Larrouture［4］等研究植物乳杆菌具有脂肪降解能力的结论相一致。A组香肠中醇类物质相对含量为21.29%，高于 B组、C组和D组的17.91%、15.94%和14.63%。虽然醇类物质的阈值较高，但它具有香甜花香味，且对醛类和酯类等物质的产生必不可少，从而会改善香肠的整体风味。

就酯类物质而言，它是促进川味香肠风味形成的重要物质，1～10的酸生成的酯一般赋予发酵香肠果香甜味的特性，能体现发酵香肠的典型风味，如辛酸乙酯具有酒香味，苯甲酸乙酯具有浓烈的蜂蜜香味，己酸乙酯具有果香味［11］。酯类物质主要来源于在微生物的作用下，酸类物质和醇类物质之间进行的酯化反应。乙酸芳樟酯在4种川味香肠中含量皆为最高，在智能化控温控湿且接种混合发酵剂生产的低酸川味香肠中己酸乙酯和辛酸乙酯的含量也较为丰富，这2种物质都对低酸度川味香肠的风味形成起到重要作用。A组香肠中酯类物质的相对含量为22.16%，明显高于B组、C组和D组的13.67%、13.21%和16.91%。，这与王海燕研究的法式发酵香肠的接种发酵剂的42.10%和自然发酵的25.32%的相似［12］。

就醛类物质而言，它具有较低的阈值［13］，因此对发酵香肠风味形成的贡献很大。低级醛具有特殊的气味，通常C3和C4醛具有强烈的刺激性气味;C5～C9醛具有油蜡和油腻味;C10～C12醛具有柠檬味和橘皮味［14］。A组(低酸度川味香肠)中的种类数量最多。A组香肠中醛类物质相对含量为14.26%，明显高于B组、C组和 D组的11.68%、10.51%和10.45%。己醛具有清香和草香气味，是ω-6不饱和脂肪酸的主要讲解产物［15］，它既可来源于酯化的亚油酸，又可来源于游离的亚油酸。A组香肠中相对含量较高的个体风味成分主要有己醛和壬醛，己醛的含量在4种川味香肠最终最高，高含量的己醛可以明显的改善香肠风味，这与Forss等人的研究结果相似［16-17］。4种川味香肠中均检测到了苯甲醛，该物质具有苦杏仁味，对川味香肠风味的形成具有重要作用。Casaburi［18］等研究发现游离脂肪酸是挥发性风味成分的主要前提物质，由于乳酸菌对脂肪的分解作用，使得醛类物质大量存在于川味香肠中。

就酮类物质而言，它一般由美拉德反应生成，也可能是脂肪的氧化、降解反应等生成［19］。酮类挥发性成分一般呈奶油味或者果香味，是香气的重要组成成分，它可以是醇的氧化产物也可以是酯类分解产物，酮类物质的阈值很低对发酵肉制品的风味有重要重要作用［20］。在4种川味香肠中，A组酮类物质的相对含量为 2.51%，高于 B组、C组和 D组的1.61%、1.74和 1.57%，这与许慧卿［21］等研究接种米酒乳杆菌对发酵香肠挥发性物质的影响结果相似。

就脂肪烃类物质而言，A组和C组川味香肠中的种类数较为丰富，分别为26种和23种。脂肪烃类物质主要包括烷烃、烯烃和芳香烃，一般认为烃类物质呈味阈值较高，对风味贡献不大［22］。β-石竹烯为脂肪烃类的代表成分，为4种川味香肠的共有物质，它属于萜类物质，其来源于添加的胡椒粉，具有很强的辛辣风味。苯乙烯在A组香肠和C组香肠中被检测出，相对含量分别为0.23%和0.21%，这种物质对改善香肠风味具有一定作用。4种川味香肠中脂肪烃类物质的差异主要体现在3-蒈烯、罗勒烯和γ-榄香烯这3种成分上。其中，γ-榄香烯是低酸度川味香肠特有的成分。此外，在4种川味香肠中，相对含量较高的物质还有柠檬烯、β-月桂烯，其均属于萜类物质。

就酸类物质而言，4种川味香肠中，乙酸的相对含量均为最高，微生物对碳水化合物的代谢产生乙酸，植物乳杆菌和戊糖片球菌都是常用的发酵香肠的发酵剂，一般活性较高;此外，除过微生物发酵途径，氨基酸与脂肪代谢也会产生乙酸，固有大量乙酸积累［23］。A组和C组川味中乙酸相对含量明显高于B组和D组，这是由于A组和C组川味香肠中接种了乳酸菌，微生物发酵的结果，而A组香肠中乙酸的相对含量为1.35%，其明显高于C组的0.33%，这是因为A组接种的乳酸菌在较适宜的温度和相对湿度下生长，微生物代谢旺盛，而C组接种的乳酸菌在较低的环境温度下，生长缓慢，代谢较慢所致。此外，A组(低酸度川味香肠)中还检测到了己酸、乙二酸和甲氧基乙酸，己酸的生成可能是由于乙醇含量较高，其与丁酸反应，最终丁酸全部转换成了己酸，其中间产物丁酸也是一种重要的挥发性物质，对川味香肠风味的形成具有重要的作用;己酸会进一步反应生成己酸乙酯［24］，因此A组(低酸度川味香肠)中己酸乙酯和己酸的含量均较高。酸类物质在发酵香肠中是非常重要的风味物质，它可以促使香肠复杂风味的形成，使发酵香肠形成其独特的发酵风味，同时它是酯类生成的中间物质。

杂环类化合物主要来源于还原糖与氨基酸发生的美拉德反应产物，其具有较低的阈值，是发酵香肠重要的呈味物质［25］。2-戊基呋喃在4种川味香肠中均被检测到，分别为 0.63%、0.36%、0.75%和0.47%，其相对含量较少，它被认为是亚油酸的一种氧化产物，具有类似火腿的香味［26］，对改善香肠风味具有一定作用。

3 结论

通过HS-SPME结合GC-MS可以较好的分析4种不同加工条件下生产的川味香肠的挥发性成分，其中脂肪烃类、酯类和醇类物质是主要的挥发性风味物质。其中A组(低酸度川味香肠)中酯类、酸类和脂肪烃类物质的种类数较多，而酯类、醇类、和醛类物质的相对含量分别为22.16%、21.29%和14.26%，均显著高于B组、C组和D组。就个体风味成分而言，4种川味香肠中芳樟醇、己醛和乙酸芳樟酯的相对含量均较高，除此之外，每种川味香肠中其它相对含量较高的风味成分在种类和数量上均存在较大差异。A组(低酸度川味香肠)中乙酸相对含量明显高于其它组，此外，乙二酸、甲氧基乙酸和己酸均在低酸度川味香肠中检测到。4种川味香肠的挥发性成分主要来自于脂肪的降解氧化、碳水化合物和蛋白质在加工过程中的生化反应及香辛料和发酵剂的作用。

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