扬子鳄、家鸡及大鼠中脑TH、nNOS表达的差异比较与分析

李怀斌 吴 锋 龚 鑫 汪仁平 熊克仁＊

（1皖南医学院解剖学教研室，芜湖241002；2安徽省扬子鳄繁殖研究中心，宣城242000）

扬子鳄又称中华鳄，为两栖卵生爬行动物，野生数量稀少，已列为国家一级重点保护动物。目前开展的主要是对扬子鳄的分子生物学及饲养种群的遗传多样性和物种保护性研究［1，2］。扬子鳄脑内中脑较发达，中脑视叶是扬子鳄的较高级中枢［3，4］。中脑的腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）和黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）是大鼠、家鸡脑干多巴胺（dopamine，DA）能神经元较集中的分布区，酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）对DA生物合成的调节起着重要作用，经多条途径影响运动的调节等，具有重要的神经生理功能［5－7］。有报道中脑VTA区神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）有助于调节TH的表达，并在脑的奖赏系统通路中起一定作用［8］。扬子鳄属爬行纲，家鸡属于鸟纲，大鼠属于哺乳纲，均属脊椎动物门，三种动物代表着从低等到较高等的进化趋势。因此，分析研究三种动物中脑内TH、nNOS的表达差异，将有助于为生物进化及扬子鳄种群遗传保护等方面的深入研究提供更多的形态学依据。本项目采用免疫组织化学染色方法结合计算机图像分析对三种动物中脑内TH、nNOS免疫反应阳性神经元的分布情况和形态特征进行观察与分析探讨。

材料和方法

1.实验动物

扬子鳄6只（体重30±5kg），家鸡15只（体重1000±100g），SD大鼠15只（体重200±20g）。三种动物雌雄不拘。

2.主要试剂及仪器

TH一抗购自SIGMA公司；SABC、DAB显色试剂盒及nNOS一抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；DHB－9082型电热恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；Olympus显微镜（日本）；黑马病理图像分析仪（型号 Hema GSM－2000P，产地：深圳）

3.实验方法

受扬子鳄脑取材限制，三种动物再各分三次进行实验，即每次扬子鳄2只，家鸡和SD大鼠各5只。各组动物在同一时间内处死后，迅速取出中脑，固定于4%甲醛固定液中，固定后梯度脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋。每组每只动物中脑的相同节段分别取连续切片5张（片厚5μm）。常规脱蜡、脱水，微波热修复，滴加TH抗体（稀释比例为1∶1000）、nNOS抗体（稀释比例为1∶100），采用SABC法进行染色，DAB显色后再进行常规脱水和透明，以中性树胶封片，利用Olympus光学显微镜观察切片。

4.结果观察

在10×10倍视野下对TH、nNOS免疫反应阳性细胞的分布部位进行观察，利用黑马病理图像分析系统对每张切片中脑导水管周围背侧内、外侧部在10×40倍视野下进行TH、nNOS阳性细胞计数；细胞形态分类统计；细胞大小测定（胞体最大径）和平均灰度值测定。将阳性细胞分为大、中、小三类：胞体最大径＜10μm为小型细胞，胞体最大径介于10～20μm之间为中型细胞，胞体最大径＞21μm为大型细胞［9］。

5.统计学处理

三种动物各组收集数据的样本数（扬子鳄n＝6，家鸡、大鼠n＝15）。统计与分析采用SPSS13.0软件。数值变量资料以表示，多组之间比较采用单因素方差分析或秩和检验，多组间两两比较采用SNK－q检验或秩和检验。以α＝0.05为检验水准，依据P＜0.05判定有统计学意义。

结 果

1.10×10倍视野下三种动物中脑TH、nNOS阳性神经元共同分布部位观察

扬子鳄中脑导水管周围灰质、中脑视叶、中脑被盖等部位；家鸡中脑导水管周围灰质、红核、黑质等部位；大鼠中脑导水管周围灰质、红核、黑质、中脑被盖等部位均可见TH、nNOS阳性神经元。本实验三种动物均选中脑导水管周围背侧灰质的TH、nNOS阳性神经元进行对比观察，其中TH阳性神经元胞浆与胞膜呈现棕色或棕褐色；nNOS阳性神经元胞浆与胞膜呈现棕黄色或棕色（图1、2）。

图1 三种动物中脑导水管周围背侧灰质TH阳性神经元（免疫组化染色 ×100），图中标尺示100μmFig.1the TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×100），scale bar＝100μm

图2 三种动物中脑导水管周围背侧灰质nNOS阳性神经元（免疫组化染色 ×100），图中标尺示100μmFig.2the nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×100），scale bar＝100μm

图3 三种动物中脑导水管周围背侧灰质内侧部TH阳性神经元（免疫组化染色 ×400），图中标尺示20μmFig.3the TH positive neuron in the medial part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

2.10×40倍视野下三种动物中脑TH、nNOS阳性神经元的分布特征比较

扬子鳄、家鸡、大鼠中脑导水管周围背侧灰质内、外侧部均可见大、中、小型的圆形、椭圆形、梭形和多角形的TH、nNOS阳性神经元。在扬子鳄、家鸡、大鼠三者中脑导水管周围背侧灰质的TH、nNOS阳性神经元数量均呈依次增多（三组间两两比较P＜0.05），细胞平均灰度值依次减少（三组间两两比较P＜0.05），说明阳性细胞着色程度依次加深。其中对细胞大小的观察结果为：三种动物中脑导水管周围背侧灰质内、外侧部TH、nNOS阳性神经元均以中型细胞为主（约占35%－50%），大型细胞以扬子鳄中脑导水管周围背侧灰质相对较多（约占26%－28%），小型细胞所占百分比三者较接近；对细胞形态的观察结果为：扬子鳄中脑导水管周围背侧灰质内、外侧部TH、nNOS阳性神经元均以椭圆形为主（约占38%－42%），家鸡均以圆形为主（约占36%－38%），大鼠以椭圆形、梭形细胞为主（约占30%－33%）（表1、2，图3－6）。

表1 三种动物中脑导水管周围背侧灰质TH阳性神经数量及灰度值比较（）Table 1 comparison of the number and gray value of TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

表1 三种动物中脑导水管周围背侧灰质TH阳性神经数量及灰度值比较（）Table 1 comparison of the number and gray value of TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

类别（kind）细胞总数（Totally number）内侧部（medial part）外侧部（lateral part）灰度值（Gray value）内侧部（medial part）外侧部（lateral part）扬子鳄（alligator sinensis，n＝6） 29.25±4.27a 35.83±4.96a 165.52±9.98a 164.51±13.01a家鸡（domestic chicken，n＝15） 38.53±3.51b 43.00±4.97b 129.72±5.84b 129.37±7.82b大鼠（rat，n＝15） 66.27±4.64c 64.73±5.54c 109.65±4.54c 108.97±3.64c F 246.698 94.887 176.550 117.111 P 0.000 0.000 0.000 0.000

注：两两比较采用SNK－q检验或秩和检验，两组间字母不同表示P＜0.05，字母相同表示P＞0.05。

（Pairwise comparisons using SNK－q test or rank sum test，the letters are different between the two groups，P＜0.05，the same letter，P＞0.05）

表2 三种动物中脑导水管周围背侧灰质nNOS阳性神经数量及灰度值比较（）Table 2 comparison of the number and gray value of nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

表2 三种动物中脑导水管周围背侧灰质nNOS阳性神经数量及灰度值比较（）Table 2 comparison of the number and gray value of nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

注：两两比较采用SNK－q检验或秩和检验，两组间字母不同表示P＜0.05，字母相同表示P＞0.05。（Pairwise comparisons using SNK－q test or rank sum test，the letters are different between the two groups，P＜0.05，the same letter，P＞0.05）

类别（Kind） 细胞总数（Totally number）内侧部（medial part）外侧部（lateral part）灰度值（Gray value）内侧部（medial part）外侧部（lateral part）扬子鳄（alligator sinensis，n＝6） 22.00±2.85a 22.67±2.73a 152.83±8.20a 154.03±9.51a家鸡（domestic chicken，n＝15） 43.23±5.16b 43.90±4.79b 127.47±9.20b 127.01±9.23b大鼠（rat，n＝15） 66.70±5.42c 77.70±6.76c 100.9±11.75c 98.18±5.60c F 191.321 261.781 60.964 117.325 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图4 三种动物中脑导水管周围背侧灰质外侧部TH阳性神经元（免疫组化染色 ×400），图中标尺示20μmFig.4the TH positive neuron in the lateral part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

图5 三种动物中脑导水管周围背侧灰质内侧部nNOS阳性神经元（免疫组化染色 ×400），图中标尺示20μmFig5the nNOS positive neuron in the medial part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

图6 三种动物中脑导水管周围背侧灰质外侧部nNOS阳性神经元（免疫组化染色 ×400），图中标尺示20μmFig6the nNOS positive neuron in the lateral part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

讨 论

从种系发生的角度看，扬子鳄、家鸡及大鼠分别代表着从低等到较高等的进化趋势；从胚胎学上来看，他们又代表着从卵生到胎生的演化；从活动规律来看，扬子鳄喜静而大鼠喜动，家鸡的活动特性处于二者之间。

实验免疫组化结果显示扬子鳄、家鸡及大鼠中脑内同一节段TH、nNOS免疫反应阳性神经元的表达均呈由弱到强。TH是脑内DA能神经元的合成酶，DA是脑内最主要的儿茶酚胺类神经递质［5－6］。中脑DA能神经元主要集中在SNc和VTA，并与纹状体、大脑皮质及边缘叶形成DA神经环路，对躯体运动、认知与思维能力、情绪反应的调节起重要作用［7］。有研究表明中脑VTA区TH的表达在脑的奖赏系统被激活时表达增加的水平受nNOS基因调节［8］。有研究表明nNOS免疫阳性神经元可通过其所分泌的NO对其他神经递质起调节作用，并参与内脏活动、感觉和运动的传导，以及睡眠和觉醒等脑的高级整合功能的调节［10］。本实验结果结合上述资料提示三种动物中脑内TH、nNOS的表达差异，可能与不同物种动物执行相关功能的复杂程度有关，其中nNOS可能对物种进化过程的中脑TH的表达逐渐增加起调控作用，但确切机制有待进一步研究。

实验同时对三种动物中脑TH、nNOS免疫反应阳性神经元的大小、形态进行了观察并比较，结果显示三种动物脑干内TH和nNOS阳性神经元的大小、形态存在一定的差异。其中对大鼠和家鸡观察到的结果与已有的报道基本一致［11－14］，而扬子鳄中脑内侧部的大型TH、nNOS阳性神经元所占比例较家鸡和大鼠均高，这可能是扬子鳄脑中脑较发达及中脑视叶是其较高级中枢的形态学基础，是否与其追逐食物、逃避敌害等有关还有待进一步研究。至于TH、nNOS免疫反应阳性神经元在三种动物间呈现的形态上的异同，原因我们尚不清楚，但也为进一步研究扬子鳄脑的形态与功能积累了一定的形态学资料。

［1］王立德，吴孝兵.中国扬子鳄保护存在的主要问题及管理对策研究.阜阳师范学院学报（自然科学版），2010，27（3）：58－61

［2］Wan QH，Pan SK，Hu L，et al，Genome analysis and signature discovery for diving and sensory properties of the endangered Chinese alligator.Cell Research，2013，23：1091－1105

［3］陈壁辉，花兆合，李炳华.扬子鳄.合肥：安徽学技术出版社，1985

［4］马同军，龚鑫，熊克仁等.扬子鳄中脑视叶NOS、AChE阳性神经元的分布.中国组织化学与细胞化学杂志，

2010，19（3）：283－286

［5］Kempadoo KA，Tourino C，Cho SL，et al.Hypothalamic neurotensin projections promote reward by enhancing glutamate transmission in the VTA.J Neurosci，2013，33（18）：7618－7626

［6］Tolosa A，Zhou X，Spittau B，et al.Establishment of a survival and toxic cellular model for Parkinson＇s disease from chicken mesencephalon.Neurotox Res，2013，24（2）：119－129

［7］镇学初，张海.多巴胺受体新型信号转导通路及其在脑机能调节中的意义.咸宁学院学报（医学版），2005，19（6）：449－452

［8］Balda MA，Anderson KL，Itzhak Y.The neuronal nitric oxide synthase（nNOS）gene contributes to the regulation of tyrosine hydroxylase（TH）by cocaine.Neurosci Lett，2009，457（3）：120－124

［9］熊克仁，郑培敏.大鼠尾壳核头部一氧化氮合酶阳性神经元区域性分布和脑缺血后变化.动物学报，1999，45（1）：73－79

［10］邵韵平.一氧化氮合酶的遗传、生理研究进展.生物学杂志，2011，28（5）：77－78

［11］姜宇，曾水林，徐春华等.大鼠腹侧中脑多巴胺能神经元的形态学发育与分布特征.神经解剖学杂志，2011，27（3）：276－280

［12］沈伟哉，郭国庆，邢旭光等.大鼠脑干神经元型一氧化氮合酶免疫阳性神经元的分布.解剖学研究，2002，24（2）：138－140

［13］孙静，王珏，徐群渊等.不同日龄鸡胚脑内酪氨酸羟化酶阳神经元的形态学发育.山东医药，2006，46（31）：23－24

［14］von Bartheld CS，Schober A.Nitric oxide synthase in learning－relevant nuclei of the chick brain：morphology，distribution，and relation to transmitter phenotypes.J Comp Neurol，1997，383（2）：135－152