花生内源过敏原蛋白Ara h 2的分离纯化及鉴定

朱青青 张文举 蔡 琴 陈 沁（上海大学生命科学学院，上海 200444）

近年来，食物过敏引起了人们的广泛关注。据世界粮农组织（FAO）1995年报告，90%以上的食物过敏是由牛奶、蛋、鱼、甲壳类水产动物、花生、大豆、坚果类和小麦引起的［1］，其中花生致敏人数占食物过敏的59%［2］，相对于其他过敏原而言，花生过敏具有长期性、普遍性，甚至威胁生命等特点。目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11种，其中Ara h 1、Ara h 2、Arah 3、Ara h 6属于主要过敏原，可被90%花生过敏患者识别［3］。而Ara h 2被认为是致敏性最强的花生过敏原之一，其cDNA序列全长为477bp，编码158个氨基酸，分子量17～20kD，pI为5.2，约占花生蛋白总量的10%［4］。Ara h 2有Ara h 2.01和Ara h 2.02两个亚型［5］，称为同种异型物，Ara h 2.02比 Ara h 2.01多1个由12个氨基酸构成的IgE结合表位，因此其致敏性可能更严重［6］。

为深入研究花生过敏机理，获得大量高纯度的花生Ara h 2蛋白是关键。对于Ara h 2的分离纯化方法已有很多报道，如 Burks［7，8］、张英坤［9］等通过花生脱脂，离子交换层析等方法分离得到Ara h 2蛋白。由于脱脂时使用的有机溶剂丙酮等可能会使蛋白质变性或沉淀［10，11］，在本研究中花生不经过脱脂，粗提蛋白直接过DEAE－Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，并用SDS－PAGE和 MALDI—TOF/MS分离、纯化并鉴定目的蛋白，为进一步开展花生过敏原Ara h 2致敏机理研究提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

花生：四粒红，购于上海市某大型超市；

预染Marker：天根生化科技（北京）有限公司；

DEAE－Sepharose Fast Flow预装柱：博格隆（上海）生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器

垂直板型电泳槽：PowerPacTMBasic型，美国BIO－RAD公司；

蛋白纯化仪：AKTA Purifier型，美国General Electric公司；

恒温磁力搅拌器：81－2型，上海志威电器有限公司；……