TDZ对杏香兔耳风组培苗复壮的影响

李峰卿，姚甲宝，曾满生，厉月桥，袁雅琪，周新华

（中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600）

TDZ对杏香兔耳风组培苗复壮的影响

李峰卿，姚甲宝，曾满生，厉月桥，袁雅琪，周新华

（中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600）

为了了解TDZ对组培苗增殖的影响情况，探讨了TDZ在衰退组培苗复壮过程中的作用，以增殖衰退的杏香兔耳风组培苗为试验材料，就TDZ的不同添加方式（抽滤灭菌和高压灭菌）和不同浓度（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L）处理对组培苗增殖系数、有效芽及苗高生长的影响情况进行了试验。结果表明：当TDZ的浓度＞0.2 mg/L时，TDZ的添加方式对组培苗的增殖系数和有效芽数均有较大影响，抽滤灭菌后的增殖系数和有效芽数要明显高于高压灭菌的；不同浓度的TDZ对有效芽数和髙生长的影响均有极显著的差异性（P＜0.01），当TDZ浓度为0.8 mg/L时，苗质量总体达到最优，增殖系数为5.11，达到了预期的复壮效果；最优生根培养基配方为1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋IBA 0.1 mg/L。在杏香兔耳风组培苗复壮过程中，TDZ可作为一种有效的植物生长调节剂使用。

杏香兔耳风；TDZ；组织培养；增殖；复壮

苯基噻二唑基脲（Thidazuron，TDZ）是西德Schering公司早于1976年就宣布合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物[1]，Mok在对棉豆的研究中首次发现其有很强的细胞分裂素活性[2]，其活性超过了玉米素。近年来，在许多植物的组织培养中，它能诱导离体材料多种途径形态发生，具有生长素和细胞分裂素的双重作用[3]，常用作形态发生的调节剂。

杏香兔耳风Ainsliaea fragransChamp为菊科兔耳风属植物，有白走马胎、金边兔耳草、一枝香等别名[4]，是江西特有的重要林下药用植物，全草可入药，具有清热补虚、凉血止血、利湿解毒之功效，其药用价值很高。然而，随着其药用价值研究的广泛和深入，市场用药量急剧增加，而该植物不仅整株被采集，且采集时间又在开花结实之前，致使野生杏香兔耳风资源无法完成世代更替，天然资源日渐枯竭。近几年，江香梅等人分别以不同的材料作为外植体进行了组织培养和快速繁殖的研究[5-7]，但普遍存在组培苗增殖倍数低、生根率低及移栽成活率低等问题，尚未形成较成熟的快繁技术体系，难以实现产业化育苗。以往的相关研究多采用嘌呤型细胞分裂素（如6-BA、KT等），但至今还未见到应用TDZ对其组培苗复壮的研究报道。笔者在兔耳风组培试验中发现，试管苗在离体连续培养30多代后其生长增殖出现衰退，为了恢复其生长增殖能力，就TDZ的不同添加方式和不同浓度处理对其组培苗增殖系数、有效芽及苗高生长的影响情况进行了试验研究，以期建立长久、高效的快繁体系。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用外植体均取自MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培养基上继代增殖一年半以上的杏香兔耳风无菌试管苗。

1.2 方 法

1.2.1 TDZ的不同浓度处理

取继代次数相同、株高均匀一致的杏香兔耳风单株接入以下培养基中：MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L（此为快繁试验中筛选出的最佳培养基）和0.0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L的TDZ，复壮第一代时每个处理接种14瓶，每瓶6株，继代周期为25 d/次。

1.2.2 激素添加方法

BA和NAA均在灭菌之前加入，TDZ是先将其pH值调至5.8，经0.2 μm的微孔滤膜抽滤灭菌后，待经121℃高压灭菌17 min后的培养基温度降至60～80 ℃时再加入。

1.2.3 生根培养

采用如表1的三因素二水平L4（23）正交试验设计，其中A、B、C三因素分别代表有无经TDZ复壮（即TDZ和TDZ0）、NAA浓度（0.02和0.10 mg/L）及IBA浓度（0.02和0.10 mg/L）。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal test design

1.3 培养条件

基本培养基选用MS培养基，其蔗糖含量为30 g/L，卡拉胶6.7 g/L，pH值为5.8，培养室的温度设为（25±2）℃，湿度为40%～70%，光周期10 h/d，光照强度1 500～2 000 Lx。

1.4 测定与数据统计

在接种30 d后，在接种的14瓶中随机抽取6瓶进行数量和高度的统计，统计指标包括0.5～1.0 cm的芽数、＞1.0 cm的芽数、芽的增殖倍数、总芽数、根的数量，测量苗高及根的长度。

有效芽＝（0.5～1.0 cm的芽数）＋（＞1.0 cm的芽数）。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel2003软件进行数据处理，采用SPASS16.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 TDZ的添加方式对组培苗增殖生长的影响

TDZ的添加方式对组培苗增殖生长的影响情况如图1 所示。由图1可知，TDZ的添加均提高了组培苗的增殖系数，随着TDZ浓度的增加，其增殖系数呈增加趋势，且均在TDZ浓度为0.8 mg/L时达到了最大，抽滤灭菌的最大增殖系数为5.11，而高压灭菌的最大增殖系数为4.53，与抽滤灭菌后TDZ浓度分别为0.8和1.0 mg/L的增殖系数相当；相比之下，杏香兔耳风的增殖系数，经抽滤灭菌加入TDZ的要明显高于高压灭菌加入TDZ的。

图1 TDZ的添加方式对组培苗增殖生长的影响Fig. 1 Effect of added ways of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings

TDZ的添加方式对组培苗的有效芽数和苗高的影响情况如图2 所示。由图2可知，TDZ的添加在一定程度上能促使苗高的增长，但是，TDZ的两种添加方式对苗高的影响并不明显。当TDZ经高压灭菌加入时，组培苗的有效芽个数处于持续增长的趋势。而以抽滤灭菌方式添加TDZ后，当TDZ的浓度在0.8 mg/L时，其有效芽个数达到了最大值，随后下降；当TDZ的浓度在1.0 mg/L时，TDZ两种添加方式影响下的有效芽数基本持平；当TDZ的浓度在0.4～1.0 mg/L时，添加了TDZ的各处理的有效芽数均显著（P＜0.05）高于对照（不添加TDZ）。而以另一种方式添加TDZ后，当TDZ的浓度高于0.8 mg/L时，其有效芽数才显著（P＜0.05）高于对照。

2.2 不同浓度的TDZ对兔耳风不定芽增殖及髙生长的影响

图2 TDZ的添加方式对组培苗有效芽数及苗高的影响Fig. 2 Effect of added ways of TDZ on effective bud number and seedling height in tissue culture seedlings

不同浓度的TDZ对兔耳风不定芽增殖及苗髙生长的影响情况如表2。试验中发现，随着在同一培养基中的继续培养，不同浓度的TDZ处理的不定芽增殖系数及苗髙生长均发生了明显的变化，继代第3次的增殖生长已趋于稳定状态，因此，本试验统计的是继代3次后的结果。表2表明，不同浓度TDZ处理的增殖系数在3.67～5.11之间，均显著高于对照，比对照提高了1.38～1.92倍。随着TDZ浓度的增加，其增殖系数呈先增加后降低的变化趋势，增殖系数最高达到了5.11，显著高于TDZ浓度分别为0.2、0.4、0.6和1.0 mg/L的各处理。

表2 不同浓度的TDZ对兔耳风不定芽增殖及苗髙生长的影响†Table 2 Effect of different concentrations of TDZ on adventitious bud proliferation and seedling height in A. fragrans

随着TDZ浓度的增加，虽然总芽数和苗高呈升高趋势，但是有效芽数及其所占总芽数的比率在达到一个峰值后，又有略微下降的趋势。从芽的质量状况来看，当TDZ的浓度达到1.0 mg/L时，苗高达到了2.84 cm，但植株茎干细弱，叶卷曲，苗木呈玻璃化状。综合来看，TDZ浓度在0.8 mg/L时，其苗高虽然比浓度为1.0 mg/L的TDZ处理的低，但其增殖系数、有效芽数均达到了最大值，其主茎粗壮，叶色浓绿，植株健壮，苗质量总体达到最优，使已经严重退化的试管苗又恢复了正常的增殖生长能力，达到了预期的复壮效果。

2.3 不同浓度的NAA和IBA对兔耳风组培苗生根的影响

以1/2MS培养基作为基本培养基，分别选取健壮、苗高＞1 cm并在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋TDZ 0.8 mg/L培养基（以下简称TDZ）上连续培养3代以上的试管苗和在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培养基（以下简称TDZ0）上获得的试管苗进行生根试验，结果见表3。

根的质量是影响组培苗移栽成活率的关键因素之一。试验中选用生根率、根长及根数这3个指标来评价杏香兔耳风根的质量，同时采用排队评分法，将多指标转化为单指标进行数据分析，继而确定各项指标的优劣度和重要性。按生根率排队，4号试验为70%，排在最后，计1分；3号试验为97%，最高，计10分；其他试验号各指标值的得分视其与该指标最优值的差异按比例计分，将每号试验的所有指标的分数相加即得综合评分，如表4所示。由表4可知，2号试验的综合评分最高，即试验条件为A1B2C2，影响因素的主次顺序为C、B、A，较佳试验处理为A2B1C2。可见，A因素的影响最小，即TDZ处理对组培苗生根的影响不大。由此得出，最优的生根培养基配方为：1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋IBA 0.1 mg/L。

表3 正交试验结果Table 3 Result of the orthogonal test

表4 各项试验指标的排队评分结果和极差分析结果Table 4 Result of scoring and range analysis of each tested index

3 结论与讨论

有关研究结果表明，TDZ用于西南桦[8]、桑树[9]、黑荆树[10]等组织培养中均可诱导芽的发生和增殖。本研究结果表明，在杏香兔耳风组织培养过程中，TDZ的添加对其不定芽的增殖具有明显的促进作用，并且同其他植物生长调节剂一样，具有一定的作用范围，这种低质量浓度处理可促进生长而高质量浓度处理却抑制生长的特性产生的原因可能是，外植体内部的内源激素与TDZ在低浓度时维持着一定的平衡状态，而高浓度处理打破了二者的平衡，从而抑制其生长[11]。TDZ细胞分裂素活性强于6-BA，最高的增殖系数达到了5.11，要高于江香梅等人[5]研究的结果（5.05），此时组培苗的叶绿、大且伸展，苗粗壮，组培苗的质量要优于江香梅等人单独使用6-BA培育的苗木质量，这也说明了TDZ与6-BA有很好的协同促进作用，这与陈宗礼等人[12]对枣树的研究结果一致，其作用机理可能与TDZ可诱导细胞分裂的生物合成，抑制内源生长素的降解有关[13]。在含有TDZ的培养基中，已衰退的组培苗的增殖能力又重新得到了恢复，表现出了良好的生长态势；在香椿的组培快繁中也有同样的研究报道[14]。这可能与TDZ处理引起了植物组织和器官内酶动力学的改变，延缓了离体叶片的叶绿素降解速度[15]，改变了细胞膜的透性[16]等有关，从而提高了组培苗增殖能力，改善了组培苗的质量。但是，TDZ的不同添加方式对杏香兔耳风增殖的适宜浓度范围的影响有差异，这可能与高压灭菌影响了TDZ的活性有关。有关研究结果表明，TDZ的活性取决于其特殊结构，如果其结构被改变则其活性会降低[2]，试验中发现，TDZ经高压灭菌后其活性低于抽滤灭菌方式的，这可能因为高温高压灭菌在一定程度上破坏了TDZ的分子结构，但具体原因还需要进一步的研究。

不定芽的数量及高度均影响苗木的生根。许多研究结果都表明，低质量浓度的TDZ可诱导产生大量的丛生芽，且能促进芽的伸长；高质量浓度的TDZ虽能产生大量的不定芽，但会抑制组培苗的伸长生长[10，17]。本研究结果表明，TDZ亦能诱导产生大量的不定芽，但是有效芽的个数有所减少，且组培苗茎干纤弱，不利于后期生根。

TDZ对组培苗生根的影响因物种不同而有不同的生理效应，其用于棉花、芋等离体芽培养中有促进生根的作用[18-19]，而其对树莓、枣树和香椿等组培苗的生根却有抑制作用[12,14,20]，仙客来在含有TDZ的培养基中亦不能生根[21]。本研究结果表明，在增殖培养基中添加TDZ，对后期组培苗生根的影响不大，这与其在香椿中的试验效果一致，但其对组培苗生根的影响情况还需要进一步的试验加以证实。

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Effects of TDZ on rejuvenation of tissue culture seedlings inAinsliaea fragrans

LI Feng-qing, YAO Jia-bao, ZENG Man-sheng, LI Yue-qiao, YUAN Ya-qi, ZHOU Xin-hua
(Experimental Center of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fenyi 336600, Jiangxi, China)

In order to learn effects of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings, the function of TDZ during rejuvenation of declining tissue culture seedlings were researched, taking declining tissue culture seedlings inAinsliaea fragransas materials. The effects of TDZ added ways (leaching sterilization and high-pressure sterilization) and TDZ concentrations (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/L) on proliferation coefficient, effective bud number and seedling height were researched. The results showed that TDZ added ways had bigger effects on proliferation coefficient and effective bud number when TDZ concentration was over 0.2 mg/L, and proliferation coefficient and effective bud number in the leaching sterilization treatment were obviously higher than those in the high-pressure sterilization treatment. The effects of different concentrations of TDZ on effective bud number and seedling height had significant differences (P＜0.01).When TDZ concentration was 0.8 mg/L, the seedlings had the best quality, proliferation coefficient was 5.11, and the expectant rejuvenation effect was obtained. The optimal rooting medium was 1/2MS+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.1 mg/L. In the rejuvenation process of tissue culture seedlings inA. fragrans, TDZ could be used as an effective plant growth regulator.

Ainsliaea fragransChamp; TDZ; tissue culture; proliferation; rejuvenation

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.020 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-08-18

中国林业科学研究院基本科研业务费专项基金项目（CAFYBB2012002）。

李峰卿，工程师，博士研究生。E-mail：lfqnjfu@163.com

李峰卿,姚甲宝,曾满生,等. TDZ对杏香兔耳风组培苗复壮的影响[J].经济林研究,2015,33(3):112－115,125.

S603

A

1003—8981(2015)03—0112—04

[本文编校：伍敏涛]