新疆阿魏中阿魏酸在Caco-2细胞模型的吸收和转运研究

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新疆阿魏中阿魏酸在Caco-2细胞模型的吸和收转运研究

张海英1,2，姜林2，任燕1，周铭心1*

(1.新疆医科大学中医学院中药药理学教研室，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属中医医院药剂科，乌鲁木齐 830000)

[关键词]新疆阿魏；Caco-2细胞；肠吸收

[中图分类号]R282.71,R285.5[文献标志码]B

DOI：10.5428/pcar20150502

基金项目国家自然科学基金(81260625)

作者简介张海英(女)，博士生，副教授.

[收稿日期]2014-09-22

E-mail: zzhhyy2583@126.com

*通信作者(Corresponding author)：周铭心，E-mail:zmx9998@vip.sina.com

阿魏为伞形科植物，是新疆特色资源植物。本课题组前期研究表明，新疆阿魏乙酸乙酯提取物对人结肠癌细胞HCT116具有增殖抑制作用[1]。Caco-2细胞模型是研究药物吸收、转运和代谢常用的经典体外模型[2]，故本研究运用Caco-2细胞模型研究新疆阿魏乙酸乙酯提取物的吸收转运特性，为临床应用提供实验依据。

1材料

1.1仪器和试剂CO2培养箱、MK3酶标仪(美国Thermo公司)；六孔Transwell板(直径24 mm，生长面积4.67 cm2)和聚碳酸酯膜(孔径3.0 μm)购自美国Costar公司；

Waters

2695高效液相色谱仪和Waters XTerra RpC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)购自美国Waters公司；Millicell-ERS细胞电阻仪(美国Millipore公司)；AL204电子天平 [梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。阿魏酸对照品(批号110773-201012，中国食品药品检定研究院)；Hank’s缓冲溶液(美国Hyclone公司)；DMEM高糖培养液(批号1237839，美国Gibco公司)。

1.2细胞人结肠腺癌细胞Caco-2，购自中国科学研究院上海生化与细胞研究所。

1.3新疆阿魏乙酸乙酯提取物的制备新疆阿魏400 g，用30～60 ℃石油醚2000 ml超声提取40 min，控温在40 ℃以下，过滤；上述残渣用95%乙醇2000 ml超声提取60 min,提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩。浓缩的膏液用硅藻土拌样分散均匀后，用乙酸乙酯2000 ml超声提取2次至提取液近无色，减压回收得新疆阿魏乙酸乙酯提取物。

2方法和结果

2.1Caco-2细胞单层模型的建立Caco-2细胞用DMEM高糖培养液稀释，接种到六孔Transwell培养板上的聚碳酸酯膜上，置37 ℃，5%CO2培养箱培养。接种后每隔4 d用Millicell-ERS细胞电阻仪测定聚碳酸酯膜上Caco-2单层细胞的跨膜电阻，各孔跨膜电阻值均达到平台(>500 Ω/cm2)，即符合要求可用于实验[3]。

2.2阿魏乙酸乙酯提取物对Caco-2细胞增殖的影响将Caco-2细胞接种于96孔培养板，置CO2培养箱中培养24 h。加入阿魏乙酸乙酯提取物使终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L，培养48 h。每孔加MTT液20 μl，使用MK3酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)[1]。经测定，阿魏乙酸乙酯提取物200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L对Caco-2细胞的增殖抑制率分别为(83.10±1.21)%、(73.21±1.34)%、(51.88±1.50)%、(24.56±1.06)%、(9.74±0.75)%和(7.78±0.64)%。表明阿魏乙酸乙酯提取物浓度在0～12.5 mg/L范围内，与细胞培养48 h后细胞的存活率>90%，故确定药物浓度12.5 mg/L为最大无毒浓度，6.25 mg/L浓度对Caco-2细胞无毒性，但浓度太低，达不到仪器的检测限，故吸收转运实验选择12.5 mg/L浓度进行。

2.3HPLC分析方法的建立

2.3.1色谱条件色谱柱：Waters XTerra RpC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(17∶83)；检测波长：323 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.3.2分析方法的专属性考察分别取Hank’s缓冲液、含阿魏酸的Hank’s缓冲溶液、含阿魏乙酸乙酯提取物的Hank’s缓冲溶液各200 μl，加入1 ml甲醇，超声30 min，4.47×102×g离心10 min，取上清液，注入10 μl进行HPLC分析。另取用甲醇溶解的阿魏酸对照品溶液10 μl直接进行HPLC分析。结果表明，阿魏酸对照品与供试品的保留时间都在16.23 min[4]，供试品的色谱图在16.23 min处有一个主峰，前后有几个小峰，说明阿魏乙酸乙酯提取物主要成分是阿魏酸，还有一些其他成分。Hank’s缓冲液色谱图在阿魏酸相应出峰时间无干扰，表明本方法专属性较好。

2.3.3方法学研究精密称取阿魏酸对照品2.5 μg，置于25 ml棕色容量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，定容至刻度，配制成浓度为0.1 μg/ml的对照品储备液。再分别取阿魏酸储备液1、2、3、4、5 ml置5 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/ml的对照品溶液，按2.3.1项色谱条件进样分析。以阿魏酸对照品浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y=5.87×106x-9.5×104(r=0.996 6)，表明阿魏酸在0.02～0.10 μg/ml内线性关系良好。经考察，仪器精密度、实验重复性、实验稳定性的RSD分别为1.21%、1.71%、1.84%。平均加样回收率为99.61%，RSD为1.02%，表明本方法准确性良好，可用于阿魏酸的含量测定。

2.4阿魏乙酸乙酯提取物的吸收转运研究

2.4.1Caco-2模型的转运实验取生长21 d、符合转运条件的Transwell培养板上的聚碳酸酯膜，药物的吸收实验(AP→BL)是将浓度为12.5 mg/L的阿魏乙酸乙酯提取物溶液(其中阿魏酸为3.42 μg/ml)1.5 ml加到AP侧作为供给池，BL侧加入空白Hank’s液2.0 ml作为接收池。于30、60、90、120 min时，分别从接收池抽取200 μl的样品供分析，再加入200 μl的Hank’s液以保证接收池中的液体量为2.0 ml。按2.4.2项供试品溶液的制备进行处理，过0.45 μm微孔滤膜，进样10 μl进行HPLC分析。BL→AP侧的转运刚好相反。计算药物的渗透系数(Papp)[2,3]。

Papp=dQ/(60×dt×A×C0)

Papp单位为cm/s。Q是累积转运量 (μg)，为阿魏酸在接收池出现的总量，计算时要累加上次取样时取走的量；C0是化合物在供给池的初始浓度(3.42 μg/ml)；A是聚碳酸酯膜的表面积(cm2)，本研究为4.67 cm2，t是测定时间。

2.4.3阿魏乙酸乙酯提取物在Caco-2细胞的吸收与转运特性本研究中A为4.67 cm2，C0为3.42 μg/ml，经测定，阿魏乙酸乙酯提取物的双向累积转运情况如下：30、60、90、120 min，由AP→BL的累积转运量为(0.33±0.01)、(0.40±0.016)、(0.46±0.033)、(0.579±0.041) μg；由BL→AP的累积转运量为(0.27±0.013)、(0.357±0.018)、(0.45±0.033)、(0.522±0.036) μg。90 min时，阿魏乙酸乙酯提取物的吸收渗透系数Papp AP→BL为(5.33±0.377)×10-6cm/s，分泌渗透系数Papp BL→AP为(5.218±0.383)×10-6cm/s，Papp AP→BL/Papp BL→AP为1.02。

3讨论

在Caco-2细胞单层模型上，判定药物吸收难易的一般标准是Papp AP→BL<1.0×10-6cm/s为吸收不良的药物，吸收率在0～20%；Papp AP→BL在1×10-6～10×10-6cm/s为吸收中等的药物，吸收率在20%～70%；Papp AP→BL>10×10-6cm/s，为吸收良好的药物，吸收率在70%～100%[3]。本研究中90 min阿魏乙酸乙酯提取物的吸收渗透系数Papp AP→BL为(5.33±0.377)×10-6cm/s，表明阿魏乙酸乙酯提取物为吸收中等的药物。90 min时阿魏乙酸乙酯提取物分泌渗透系数Papp BL→AP为(5.218±0.383)×10-6cm/s，Papp AP→BL/Papp BL→AP为1.02。提示它们的吸收和外流能力相近，推测阿魏乙酸乙酯提取物在Caco-2细胞模型中的吸收没有载体转运参与，是以被动扩散为主要方式被细胞摄取。

综上所述，本研究表明阿魏乙酸乙酯提取物为吸收中等的成分，转运途径可能为被动扩散方式，为明确阿魏乙酸乙酯提取物的体内吸收提供了实验依据。

【参考文献】

[1]周龙龙,张海英,任 燕,等. 新疆阿魏树脂不同分离部位对结肠癌细胞HCT116的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(23)：183-186.

Zhou LongLong，Zhang HaiYing，Ren Yan，etal. Inhibition activity of different separation parts ofFerulasinkiangensisresin on HCT116 human colon cancer cells[J]. Chin J Exp Tradit Med Form,2013，19(23)：183-186. In Chinese with English abstract.

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[3]杨秀伟，杨晓达，王莹，等.中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作规程的建立[J].中西医结合学报，2007，11(6)：634-641.

Yang XiuWei,Yang XiaoDa,Wang Ying,etal. Establishment of Caco-2 cell monolayer model and standard operation procedures for assessing intestinal absorption of chemical components of traditional Chinese medicine[J].J Chin Integr Med, 2007，11(6)：634-641. In Chinese with English abstract.

[4]李艳秋. 用HPLC法测定四川省不同产地的川芎中阿魏酸的含量[J].药学服务与研究，2009，9(2)：153-155.

Li YanQiu.Determination of the content of ferulic acid in Rhizoma Chuanxiong from different regions of Sichuan Province by HPLC method[J].Pharm Care Res，2009，9(2)：153-155. In Chinese with English abstract.

[修回日期]2015-07-08

[本文编辑]贡沁燕