去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响

2015-12-22 14:51刘柏林刘斌223300江苏护理职业学院
中国社区医师 2015年22期
关键词:斑蝥去甲胶质瘤

刘柏林 刘斌223300江苏护理职业学院

去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响

刘柏林 刘斌
223300江苏护理职业学院

目的:探讨去甲斑蟊素对神经胶质瘤U 87MG细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测不同浓度的去甲斑蟊素对U 87MG细胞增殖的抑制作用。用ELISA实验检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达水平。结果:MTT结果表明去甲斑蟊素对U87MG细胞的增殖有抑制作用,并随浓度增加抑制作用增强;ELISA实验提示去甲斑蟊素抑制U 87MG细胞分泌VEGF蛋白。结论:去甲斑蟊素可以抑制U 87MG细胞增殖,抑制肿瘤新生血管的形成。

神经胶质瘤;U 87MG;去甲斑蝥素;血管内皮生长因子

恶性胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,目前主要的治疗方法是手术切除后辅助放疗和化疗[1]。近年来尽管其诊断技术不断提高,治疗方案不断改进,但预后较差。因为胶质瘤呈现浸润性生长,彻底切除将引起大脑严重损伤。因此,迫切需要新的治疗方法,提高生存率。近期我们用去甲斑蝥素作用体外培养的人神经胶质瘤U87MG细胞系,研究其在神经胶质瘤中的治疗作用。

资料与方法

实验材料:人神经胶质瘤U87MG细胞系购自美国 American Type Culture Collection公司(USA)。U87MG生长在含有10%胎牛血清(FBS)和P/S溶液(10 000 U/ mL青霉素,10 000μg/mL链霉素)的DMEM培养基中。并在37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱培养。

药品与试剂:去甲斑蝥素购自Sigma公司(St Louis,MO,USA),溶解在二甲亚砜(DMSO)中使用。MTT购于Serva公司,用PBS配置成5mg/mL使用浓度,避光保存。DMEM培养基、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清购于美国Gibico公司。VEGFELISA试剂盒购于德国IBL公司。

方法:①MTT法测定去甲斑蝥素对U87MG细胞增殖的影响:U87MG细胞接种于96孔板,接种密度5 000~6 000细胞/孔,约100μL,设置3个复孔;在37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱孵育24h后开始加入不同浓度的斑蝥素,空白对照组添加同等量的DMEM培养液,溶剂对照组添加同等量的1% DMSO。继续培养24h后,每孔加入10μLMTT(10mg/mL)试剂溶液,5%CO2,37℃温育4h后,去掉孔内培养液,每孔加入200μL的DMSO液体,震荡,用酶标仪测570nm波长处每孔的吸光度(A)值,结果重复3次。细胞增殖抑制率=[(对照组A值-处理组A值)/对照组A值]× 100%。②ELISA法测定去甲斑蝥素对U87MG细胞分泌VEGF的影响:根据MTT结果,实验分组:空白对照组,12μmol/L斑蝥素组,96μmol/L斑蝥素组。将细胞接种在6孔板内,37℃温箱培养,24h后,添加12μmol/L,96μmol/L去甲斑蝥素到相应孔中,空白对照添加同体积培养液体。继续37℃温箱培养24h,收集细胞上清于离心管,400g离心5min,吸去上清,保存于-80℃,备用。待上机检测时取出。设立样品对照,检测样品和标准品孔,然后分别将样品对照品、检测样品和稀释好的标准品100μL加入到相应的微孔中,37℃下孵育1h。吸出液体,然后洗涤。每孔加100μL酶标抗体(试剂空白对照孔外),4℃下温育0.5h,洗板9次。加底物显色液100μL,37℃,避光,孵育0.5h。于各反应孔中加入2M硫酸50μL。在ELISA检测仪上,检测OD450值。

统计学分析:采用SPAS 16.0 for windows软件包进行统计分析。各组之间的数据比较采用单因素重复测量资料的方差分析,所检测数据用用(x±s)表示,检验水准α=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

MTT法测定斑蝥素作用24h后对U87MG细胞增殖的影响:分别用3~384 μmol/L浓度的去甲斑蝥素作用于U87MG细胞,24h后,MTT法测得去甲斑蟊素对U87MG细胞有明显增殖抑制作用,而且随去甲斑蟊素浓度升高,抑制率也相应增加,呈明显的剂量效应关系,P<0.05,见表1。

ELISA 法测定去甲斑蝥素对VEGF 的影响:ELISA 实验提示空白组细胞VEGF 表达量明显低于12μmol/L和96μmol/L斑蝥素组, 差异有统计学意义(P<0.05),实验结果表明,斑蝥素能够抑制U87MG 细胞分泌VEGF。

讨论

现在研究表明斑蝥可以抗肿瘤,对肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤有治疗作用。对其进一步研究,发现其还具有免疫抑制及升高白细胞的作用[2-3]。对于斑蝥抗肿瘤的机制,多名学者进行了深入研究。张卫东等研究发现[3],斑蝥素可通过MAPK信号传导途径,降低ERK及phos-ERK的表达,使A549细胞增殖受到抑制。何太平等研究发现[4],斑蝥素可能通过转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路,磷酸化激活Smad后,Smad3与Smad4复合物与SBE结合,启动相关靶基因的表达,从而抑制肿瘤的发生与发展。进一步研究发现斑蝥能有诱导细胞凋亡的细胞作用。另有研究斑蝥可以抑制肿瘤新生血管的生长。Lee YC等研究表明[5],去甲斑蝥素通过阻断VEGFR2/MEK/ERK信号通路,抑制VEGF的分泌,进而使肿瘤新生血管形成减少,其迁移、侵袭能力明显下降。吴秋玲等也研究表明斑蝥可以降低MMP-9及VEGF的表达[6],通过抑制肿瘤新生血管的生长,来抑制肿瘤生长。

笔者的研究中,ELISA实验提示空白组细胞VEGF表达量明显低于12μ mol/L和96μmol/L斑蝥素组,表明去甲斑蝥素能够抑制U87MG细胞分泌VEGF。VEGF促进肿瘤新生血管形成,当VEGF分泌下降时,肿瘤新生血管形成减少,U87MG细胞迁移,侵袭力必然降低。MTT结果显示,去甲斑蝥素处理组细胞吸光度值与空白组相比,出现了明显的生长抑制现象,差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果与斑蝥素在其他肿瘤研究中的研究结果相一致。这些现象说明斑蝥素能有效抑制U87MG细胞的增殖能力,降低其产生肿瘤新生血管的能力,其具体作用机制还需要进一步研究。

综上所述,斑蝥能明显抑制U87MG细胞的增殖能力,降低其产生肿瘤新生血管的能力,对神经胶质瘤有一定治疗作用,对其进一步研究,可为神经胶质瘤治疗提供新的方法。

[1] Mannas JP,Lightner DD,Defrates SR,et al. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma[J].JClin Neurosci,2014,21 (1):121-123.

[2]李森林,肖文海,黄岩.斑蝥的现代药理研究和临床应用[J].社区用药指导,2007,9(109):16.

[3] 张卫东,赵惠儒,宗志红,等.斑蝥素通过MAPK信号传导途径对A549细胞增殖抑制作用的研究[J].肿瘤防治杂志,2004,11 (11):1151-1153.

[4] 杨寰,强亚杰.斑蝥复方药酒提物对小鼠肝癌H-22的治疗作用研究[J].河南大学学报:医学版,2013,32(4):258-261.

[5] Lee YC,Lee LM,Yang CH,et al.Norcantharidin inhibits tumor angiogenesis via blocking VEGFR2/MEK/ERK signaling pathways[J]. Cancer Sci,2013,104(5):604-610.

[6] 吴秋玲,卢宏达,郭继龙,等.水蛭斑蝥对小鼠移植肉瘤血管形成的影响[J].中国中医基础医学杂志,2012,18(6):667-669.

Effectof norcantharidin on U87MG cellproliferation

Liu Bailin,Liu Bin
Jiangsu Nursing CareerAcademy223300

Objective:To explore the effect of norcantharidin on neuroglioma U87MG cell biological behaviour.Methods:The inhibition effects of different concentrations of norcantharidin on U87MG cell proliferation were detected by MTTmethod.The expression levelofvascular endothelialgrowth factor(VEGF)proteinwas detected by ELISA test.Results:MTT results showed that norcantharidin had inhibition effect on U87MG cell proliferation,and the inhibition effect increased with the increasing concentration.ELISA test showed that norcantharidin inhibited U87MG cell secretory VEGF protein.Conclusion:Norcantharidin can inhibitU87MG cellproliferation,inhibit the formation of tumorangiogenesis.

Neuroglioma;U87MG;Norcantharidin;Vascularendothelialgrowth factor

表1 MTT检测去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖抑制的作用(x±s)

book=5,ebook=7

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.22.1

猜你喜欢
斑蝥去甲胶质瘤
去甲肾上腺素联合山莨菪碱治疗感染性休克的疗效观察
治斑秃
南方大斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响
立体选择性合成内型N-Boc-N-去甲托品醇
DCE-MRI在高、低级别脑胶质瘤及脑膜瘤中的鉴别诊断
P21和survivin蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义
Sox2和Oct4在人脑胶质瘤组织中的表达及意义
99mTc-HL91乏氧显像在恶性脑胶质瘤放疗前后的变化观察
斑蝥酸钠对人食管癌细胞作用的体外实验研究
去甲斑蝥素抑制大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的研究