闭锁小带蛋白-1在脑外伤后皮质中的表达变化

王涛，孟颖，邹冬华，李正东，陈忆九，陶陆阳

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；3.苏州高新区人民医院ICU，江苏苏州 215129）

闭锁小带蛋白-1在脑外伤后皮质中的表达变化

王涛1，2，孟颖3，邹冬华1，李正东1，陈忆九1，陶陆阳2

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；3.苏州高新区人民医院ICU，江苏苏州 215129）

目的观察闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）在脑外伤后皮质中不同时段的表达变化。方法建立小鼠脑外伤模型，分为脑外伤后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d组，同时设立假手术组及正常对照组。脑皮质中伊文思蓝（Evans blue，EB）含量检测评估血脑屏障通透性，Western印迹法和免疫组织化学染色法检测损伤皮质区ZO-1的表达。结果脑外伤后1h皮质中EB含量开始增加，伤后1～3d达高峰，伤后7d接近正常。Western印迹法显示，ZO-1在损伤1h后表达下调，损伤1～3d达到最低值，损伤7d后明显回升，但仍低于假手术组和正常对照组。免疫组织化学染色显示，正常脑皮质血管中ZO-1呈强阳性表达，损伤后表达逐渐减弱，损伤3d后阳性表达几乎消失，之后逐渐恢复。结论ZO-1在脑外伤后皮质区呈先降低后升高的表达规律，与脑外伤后血脑屏障通透性变化规律呈负相关，为推断脑外伤损伤时间提供了新指标。

法医病理学；脑损伤；闭锁小带蛋白-1；小鼠

血脑屏障对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要意义，脑微血管内皮细胞之间的紧密连接是血脑屏障结构与功能的基础[1]。目前研究发现，胞质附着蛋白、跨膜蛋白及细胞骨架蛋白共同组成了紧密连接，其中胞质附着蛋白是紧密连接结构的基础，包括闭锁小带（zonula occludens，ZO）蛋白家族[2]。已有文献[3]报道，损伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起紧密连接结构及功能发生改变造成血脑屏障损害，从而导致其通透性升高引起脑水肿。本研究通过建立小鼠脑外伤模型，观察损伤后脑皮质ZO-1的表达变化，并检测脑外伤后皮质中伊文思蓝（Evans blue，EB）的含量变化，从而阐述脑外伤后脑水肿的形成机制，并为推断脑外伤损伤时间提供新的指标。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗小鼠ZO-1多克隆抗体（ab59720，美国Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH多克隆抗体（杭州贤至生物科技有限公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0208，上海碧云天生物技术有限公司），兔SP检测试剂盒（SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司），伊文思蓝（ab120869，美国Abcam公司），ECL试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 脑外伤模型的建立及分组

取健康成年雄性CD-1小鼠81只（体质量25～30g，购于上海SLAC实验动物有限公司）。随机取63只进行建模：4%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔麻醉小鼠，采用改良的自由落体打击法，建立小鼠脑外伤模型[4]。随机分为脑外伤后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d组，每组9只。同时设立假手术组及正常对照组各9只。假手术组只开颅暴露硬脑膜，不进行打击损伤，正常对照组则不做任何处理。

每组小鼠中3只用于脑皮质中EB含量检测，3只用于Western印迹法，3只用于免疫组织化学染色法。

1.3 EB含量检测

小鼠脑皮质中EB含量测定的方法参照文献[5]，并作改进。小鼠创伤性脑损伤后于处死前2 h尾静脉注射2%EB，损伤后不同时间点4%水合氯醛麻醉后，用生理盐水对小鼠进行心脏灌流，除去未结合的染料，断头处死，迅速取损伤脑皮质称重，放入盛有3 mL甲酰胺的试管中，加上橡皮塞，60℃水浴中（避光）抽提48h，加温1h后用细棒将浮在上面的脑组织轻轻压沉，以便皮质中EB充分溶解出来。匀浆液以离心半径9.35 cm，12 000 r/min，4℃，离心20 min，取200 μL上清液于96孔板中，用ELX800吸光酶标仪（美国BioTek公司）于620nm处测定吸光度。按公式计算脑皮质中EB含量，以EB含量（μg/g）代表血脑屏障通透性的改变。

EB（μg/g）=标准品EB质量浓度（μg/mL）×甲酰胺量（mL）/脑湿重（g）。

1.4 Western印迹法

小鼠损伤后在不同时间点腹腔麻醉，经40mL生理盐水心脏灌流后断头处死。取损伤周围2mm脑皮质，-80℃保存。提取脑组织总蛋白，电泳后转移至PVDF膜上，分别加入兔抗小鼠ZO-1（1∶500）和GAPDH （1∶1000）多克隆抗体，4℃孵育过夜，0.01mol/L PBS洗膜，HRP标记羊抗兔IgG（H+L）杂交，37℃孵育2 h，ECL试剂盒显色后X线胶片显像扫描，检测ZO-1条带光密度值，将其与GAPDH的比值作为相对表达强度。

1.5 免疫组织化学染色法

小鼠损伤后在不同时间点用4%水合氯醛腹腔麻醉，经生理盐水40 mL及4%多聚甲醛溶液40 mL心脏灌流后，断头取脑皮质放入4%多聚甲醛溶液后固定4h，0.01mol/L PBS漂洗3次后转移至30%、20%、10%梯度蔗糖中脱水。冰冻切片（10μm），贴于载玻片上。采用SP法进行免疫组织化学染色，具体步骤按照试剂盒说明书。

1.6 图像采集与数据分析

采用Scion Image 4.01软件对Western印迹法检测图像进行采集与分析。在每张免疫组织化学染色切片中，于损伤侧脑皮质取5个视野（×400）摄片。所有数据用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析及两两比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EB含量检测结果

脑外伤后1h皮质中EB含量开始增加，至损伤后1～3d达高峰，伤后7d逐渐降低并接近正常（表1）。

表1 脑外伤后皮质中EB含量 （n=3，±s）

表1 脑外伤后皮质中EB含量 （n=3，±s）

注：1）与正常对照组比较，P〈0.05

组别EB含量/（μg/g）ZO-1相对表达强度正常3.47±0.341.32±0.10假手术3.58±0.351.29±0.10伤后1h4.71±0.200.91±0.081）伤后3h5.92±0.311）0.80±0.051）伤后6h7.65±0.751）0.65±0.081）伤后12h8.97±0.521）0.57±0.071）伤后1d11.84±0.531）0.44±0.041）伤后3d13.94±0.491）0.34±0.061）伤后7d4.39±0.490.99±0.081）

2.2 Western印迹法结果

假手术组ZO-1表达水平与正常对照组相当，损伤1h后ZO-1表达开始下降，并于损伤1～3d达到最低值，损伤7d后ZO-1表达明显回升，但仍低于假手术组和正常对照组（图1、表1）。

图1 脑外伤后皮质中ZO-1的表达变化

2.3 免疫组织化学染色结果

在假手术组和正常对照组脑皮质中可见明显的ZO-1免疫染色阳性血管，染色血管多，染色深；伤后1 h出现免疫染色阳性血管减少，染色变淡，至伤后1～3d免疫染色阳性血管明显减少，几乎消失；至伤后7d免疫染色阳性血管逐渐增多，染色逐渐变深，但仍低于假手术和正常对照组（图2）。

图2 脑外伤后皮质中ZO-1免疫组织化学染色结果SP×400

3 讨论

创伤性脑损伤，又称脑外伤，是指一类由外伤导致脑组织严重损害的疾病，具有高发生率、高致残率及高致死率等特点[6]，目前已成为影响人类健康的主要原因，已引起国内外医学界的高度关注和广泛研究。外伤后继发性脑水肿是脑外伤后最常见的一种继发病变，常引起颅内压增高和脑血流灌注减少，加重脑组织缺氧缺血，从而形成恶性循环，最终造成脑组织不可逆的损坏，是颅脑损伤患者致死和致残的主要原因[7]。继发性脑水肿主要分为两种类型，细胞毒性水肿（细胞内水肿）和血管源性水肿（细胞外水肿）。研究表明[1，8]，血管源性脑水肿的形成与血脑屏障完整性破坏密切相关。完整的血脑屏障由脑微血管内皮细胞、神经元、星形胶质细胞、周细胞以及包绕脑微血管内皮细胞的基底膜构成[8]，只允许小分子物质通过，当血脑屏障发生破坏时，血管内的大分子物质可通过血脑屏障渗出到细胞外间隙，从而形成血管源性脑水肿。EB与血浆蛋白结合不能通过完整的血脑屏障，当血脑屏障遭受破坏，通透性增大时，EB-血浆蛋白复合物可通过损伤的血脑屏障渗出到血管外，因此可通过检测外源性注射的EB在损伤区脑组织的含量评估血脑屏障的通透性[9]。本实验通过检测脑外伤后不同时间段皮质中EB的含量发现，脑外伤后1h即发生血脑屏障的破坏，1～3d时血脑屏障破坏最为严重，并于7d逐渐修复。这也印证了前期实验结果[10]，脑外伤后脑水肿在伤后1～3d到高峰，之后逐渐恢复。

近年来的研究发现[1，8]，颅脑损伤后脑微血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白对维持血脑屏障结构与功能发挥重要作用。ZO-1是第一个被证实的紧密连接胞质附着蛋白，相对分子质量约220000，随后ZO-2和ZO-3亚型被发现，ZO-1与“卫星分子”ZO-2、ZO-3组成ZO-1/ZO-2/ZO-3复合体，具有3个PDZ结构域，即盘状同源区域[2]。ZO-1/ZO-2/ZO-3复合体通过PDZ结构域与claudin的C端相互作用，并通过C端与肌动蛋白相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架蛋白连接在一起，从而发挥“脚手架”的功能，对维持血脑屏障的结构完整和功能发挥起至关重要的作用[11]。由于ZO-1对于各种影响血脑屏障功能的刺激敏感，使其成为一种显示紧密连接功能正常与否的可靠标志。本研究中，Western印迹法检测结果显示损伤后ZO-1表达逐渐减少，并于损伤后1～3 d达到最低值，之后逐渐回升；免疫组织化学染色结果表明在正常脑皮质血管中ZO-1呈高强度表达，脑外伤后皮质中血管遭受破坏，ZO-1表达减弱，并于脑外伤3d后表达明显减弱，甚至消失，之后逐渐恢复。上述实验结果表明，脑外伤后ZO-1呈现先降低后升高的表达规律，与脑外伤后脑水肿的变化规律呈负相关，这与脑外伤后血脑屏障的完整性遭受破坏存在直接关系。

颅脑损伤是法医学检验中最常见的死亡原因，除研究颅脑损伤的死亡机制外，准确推断颅脑损伤时间一直是法医工作者研究的难点和热点之一。本研究中Western印迹法检测结果与免疫组织化学染色结果的变化规律一致，为脑损伤形成时间的推断提供了新的参考指标。但尚未验证ZO-1在实际检案中不同时间脑损伤后脑组织的表达，且损伤程度及死亡时间是否会影响ZO-1的表达尚需进一步研究。

[1]Keep RF，Xiang J，Ennis SR，et al.Blood-brain barrier function in intracerebral hemorrhage[J].

Acta Neurochir Suppl，2008，105：73-77.

[2]Abbott NJ，Patabendige AA，Dolman DE，et al.Structure and function of the blood-brain barrier[J].Neurobiol Dis，2010，37（1）：13-25.

[3]Pardridge WM.The blood-brain barrier：bottleneck in brain drug development[J].NeuroRx，2005，2（1）：3-14.

[4]Wang T，Zhang L，Zhang M，et al.[Gly14]-Humanin reduces histopathology and improves functional outcome after traumatic brain injury in mice[J].Neuroscience，2013，231：70-81.

[5]Belayev L，Busto R，Zhao W，et al.Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Brain Res，1996，739（1-2）：88-96.

[6]Stevens RD，Sutter R.Prognosis in severe brain injury[J].Crit Care Med，2013，41（4）：1104-1123.

[7]Andriessen TM，Jacobs B，Vos PE.Clinical characteristics and pathophysiological mechanisms of focal and diffuse traumatic brain injury[J].J Cell Mol Med， 2010，14（10）：2381-2392.

[8]Zlokovic BV.The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders[J].Neuron，2008，57（2）：178-201.

[9]Carrera RM，Pacheco AM Jr，Mastroti RA.Qualitative evaluation of the blood-brain barrier after the use of hypertonic saline solution in young rats[J].Eur Surg Res，2001，33（5-6）：311-317.

[10]Bao HJ，Wang T，Zhang MY，et al.Poloxamer-188 attenuatesTBI-inducedblood-brainbarrierdamage leading to decreased brain edema and reduced cellular death[J].Neurochem Res，2012，37（12）：2856-2867.

[11]Ebnet K，Schulz CU，Meyer Zu Brickwedde MK，et al.Junctional adhesion molecule interacts with the PDZ domain-containing proteins AF-6 and ZO-1[J].J Biol Chem，2000，275（36）：27979-27988.

Expression of Zonula Occludens-1 in Cerebral Cortex Following Traumatic Brain Injury

WANG Tao1，2,MENG Ying3,ZOU Dong-hua1,LI Zheng-dong1,CHEN Yi-jiu1,TAO Lu-yang2
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;3.Intensive Care Unit,Suzhou High-tech Zone People's Hospital,Suzhou 215129,China）

Objective To observe the time-course expression of zonula occludens-1（ZO-1）in cerebral cortex after traumatic brain injury（TBI）.Methods The TBI model of mouse was established.The mice were divided in 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,3 d,7 d after TBI,sham and control groups.The permeability of the blood brain barrier was evaluated by measuring the extravasation of Evans blue（EB）dye.The expression of ZO-1 in cerebral cortex in the injured area was detected by Western blotting and immunohistochemistry.Results The extravasation of EB dye of injured cortex gradually increased from 1h, peaked at 1-3 d and approximately decreased to normal at 7 d after TBI.Western blotting revealed that the expression of ZO-1 gradually decreased after 1h,was at the lowest at 1-3d,and then significantly increased after 7d but was still lower than that of normal and sham groups.The result of immunohistochemistry showed that ZO-1 had strong expression in vessel of normal cortex,gradually decreased after TBI,and almost disappeared at 3 d after TBI and gradually recovered to normal level later.Conclusion The expression of ZO-1 in the injured cortex after TBI initially decreases and then increases.The negative correlation between ZO-1 expression and EB extravasation after TBI could be used as a new indicator for wound age estimation.

forensic pathology;brain injuries;zonula occludens-1;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.002

1004-5619（2015）02-0085-03

2014-12-22）

（本文编辑：刘宁国）

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK16B02）；国家自然科学基金资助项目（81273338、81172911）；上海市法医学重点实验室资助项目（14DZ2270800）；上海市博士后科研资助计划项目（14R21423000）；苏州市科技发展计划项目（SZP201304）

王涛（1984—），男，安徽阜阳人，博士，主要从事颅脑损伤研究；E-mail：0253010217＠163.com

陈忆九，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法医病理学研究：E-mail：chenyj＠ssfjd.cn

通信作者：陶陆阳，男，教授，博士研究生导师，主要从事颅脑损伤及ERP研究；E-mail：luyang.tao＠163.com