黑莓果酒中蛋白质提取方法研究

梁红云　王英　李清　董明盛　周剑忠

摘要：以实验室自酿的黑莓果酒为原料，采用无水乙醇沉淀法、透析冻干法和KDS法分别提取黑莓果酒中的总蛋白质，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度以及SDS-PAGE检测蛋白质的纯度，并比较3种方法之间的差异。结果表明，无水乙醇沉淀法的蛋白质提取率较高，SDS-PAGE图谱显示条带最多、最清晰；透析冻干法的蛋白质提取率最高，但SDS-PAGE图谱中呈现的条带较无水乙醇沉淀法少，条带不清晰，背景颜色较深；KDS沉淀法的蛋白质提取率最低，SDS-PAGE图谱中呈现的条带最少、最不清晰。3种方法中无水乙醇沉淀法最适于黑莓果酒中总蛋白质的提取。

关键词：黑莓果酒；蛋白质；提取方法；SDS-PAGE

中图分类号： TS262.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0349-03

随着人们生活水平提高和保健意识增强，以葡萄酒为代表的果酒，其营养价值得到广泛认可。黑莓果实柔嫩多汁、营养丰富，富含锌、硒等多种矿物质，氨基酸种类齐全，且花色苷和总酚含量较其他浆果高，被誉为第三代“黄金水果”。其所含的多酚类化合物在体内发挥抗氧化作用，可以降低心脏病、癌症和其他慢性病的发生率[1-2]。但是黑莓的果实皮薄多汁，易发生霉烂，耐储运能力较差，室内条件下存放2～3 d后果实即变软发黏，而且果实不耐搬运和翻动，因此对黑莓鲜果必须及时加工处理，并且黑莓为高酸型水果，不宜鲜食，有较强的加工属性，将其制成黑莓果酒将具有巨大的市场潜力。

作为一种商品，果酒的澄清度是决定其品质的一个重要指标，澄清透明、颜色清亮的果酒商品容易吸引消费者的眼球。虽然浑浊或带有沉淀的果酒对人体健康没有影响，但影响消费者的购买欲，进而影响销售市场，因此，不论储存条件如何，果酒必须保持较高的澄清度和稳定性才能保持果酒的商品价值。果酒的澄清工艺及澄清剂的研制是目前的研究热点[3-6]。

总体来说，引起果酒浑浊沉淀的因素分为生物因素和非生物因素。针对生物因素，在加工和储存的过程中须严格控制卫生管理。非生物因素是引起果酒浑浊及沉淀的主因，也是在酿造工艺上必须重点探讨解决的技术难点。从已有的研究结果来看，果酒中的蛋白质是引起果酒浑浊的一个主要非生物因素，果酒中的蛋白质含量较低，不是果酒中的主要营养成分，但对果酒的澄清度和稳定性有重要影响，因为果酒装瓶储存过程中蛋白质的缓慢降解导致蛋白质絮凝和聚集成颗粒，最终导致果酒的浑浊和沉淀[7-9]。大部分研究者认为果酒中蛋白质是引起果酒浑浊的一个必要因素，且蛋白质的含量越高，果酒越容易不稳定，越易发生浑浊沉淀现象，因此，果酒中的蛋白质对果酒的浑浊和沉淀都具有贡献作用[10-11]。

目前对葡萄果酒中蛋白质的提取主要采用的方法有无水乙醇沉淀法、丙酮沉淀法、TCA沉淀法、硫酸铵沉淀法、冻干透析法、十二烷基磺酸钠和氯化钾沉淀法（KDS）[12-13]。本研究选择常用的无水乙醇沉淀法、透析冻干法、十二烷基磺酸钠和氯化钾沉淀法（KDS）对黑莓果酒中的蛋白质进行提取，通过比较3种方法中蛋白质提取率和提取纯度，旨在找出一种简便快捷高效的黑莓果酒蛋白质提取方法，为研究黑莓果酒中蛋白质组分如何引起黑莓果酒沉淀提供可靠的方法，同时对充分开发利用我国的黑莓资源、提高农产品经济价值有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

黑莓初酒为江苏省农业科学院农产品加工研究所酿造。果酒酿造采取2种方式：一种为在黑莓打浆后添加0.1%果胶酶45 ℃酶解2 h；另一种位黑莓打浆后不添加果胶酶。其他的酿造条件一致。果酒未经澄清剂处理。

1.2 试剂与仪器

试剂：无水乙醇、丙酮、SDS均购自南京化学试剂有限公司；KCl，西陇化工股份有限公司；考马斯亮蓝，上海蓝季科技发展有限公司；以上试剂均为分析纯。3.5 ku的透析袋，USA。

仪器：FDU-1200真空冷冻干燥机（东京理化/EYELA）；UV-1600PC分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；SDS-PAGE电泳仪（BIO-RAD公司）；Tanon3500全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑莓果酒的前处理 分别取适量未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒样品4 ℃条件下3 000 g离心10 min，去除不溶性的大颗粒物质。弃沉淀，上清备用。

1.3.2 无水乙醇沉淀法 参照Lambri等的方法[14]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒样品，加入200 mL 无水乙醇，于4 ℃条件下沉淀72 h后，10 000 g 离心20 min，收集沉淀，重悬于超纯水中，于3.5 ku的透析袋中透析48 h，，每隔4 h换1次双蒸水。然后于真空冷冻干燥机中冻干，用5 mL蒸馏水分别溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。

1.3.3 透析冻干法 参照Marangon等的方法[15]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒于3.5 ku的透析袋中，透析48 h后，于真空冷冻干燥机中冻干，用5 mL蒸馏水分别溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。

1.3.4 十二烷基磺酸钠和氯化钾沉淀法（KDS） 参照Fusi等的方法[16]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒，10%（质量浓度）十二烷基磺酸钠（SDS）加入到黑莓酒样品中，使其终浓度为0.2% （质量浓度），沸水浴5 min，然后将2 moL/L的KCl溶液加入到样品中，使其终浓度为400 mmol/L，轻轻混匀样品后将混合液在4 ℃条件下放置45 min，4 ℃条件下14 000 g 离心15 min，收集沉淀，即为提取的蛋白质样品。将所得样品自然干燥后，分别用5 mL蒸馏水溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。endprint

1.3.5 蛋白质含量测定 参照Lambri等的方法[14]对提取的总蛋白质含量进行测定，以牛血清蛋白质（BSA）作为标准蛋白质，考马斯亮蓝G-250染色，然后于595 nm波长处比色，标准曲线方程为y=0.0083x-0.0009，r2=0.9964，结果用 mg/L表示。提取蛋白质样品冷冻干燥后加入一定体积的蒸馏水溶解，再用考马斯亮蓝G-250染色，在595 nm波长处比色。每个样品蛋白质含量均取3次测定结果的平均值。

1.3.6 蛋白质提取率 蛋白质提取率=（提取液的蛋白质含量×蛋白质提取液体积）/（黑莓酒蛋白质含量×黑莓酒样品体积）×100%。

1.3.7 SDS-PAGE分析提取的果酒蛋白质 SDS-PAGE电泳采用12.5%（体积分数）的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，5% （体积分数）的聚丙烯酰胺凝胶作为浓缩胶。冻干的蛋白质提取样品加入一定量的蒸馏水溶解，5×样品缓冲液[0.5 mol/L Tris-HC1，pH值6.8，20%（体积分数）甘油，4%（质量浓度）SDS，0.005% （质量浓度）溴酚蓝，10% （体积分数）β-巯基乙醇]稀释5倍后，与蛋白质提取液按1 ∶ 1的体积比混合，沸水浴5 min，使蛋白质变性，上样量为20 μL，浓缩胶内电泳时设置电压为80 V，当溴酚蓝线到达分离胶时把电压提高到120 V，当溴酚蓝线到达分离胶底部时停止电泳。蛋白质检测用硝酸银溶液染色，再用Tanon3500全自动数码凝胶成像分析系统拍照分析。

2 结果与分析

2.1 总蛋白质提取效果的比较

从表1可以看出，在3种方法中，透析冻干法提取的蛋白质含量和提取率最高，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（484.34±23.51） mg/L，提取率达到66.01%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（630.60±29.74） mg/L，提取率达到67.01%（质量分数）；无水乙醇沉淀法提取的蛋白质含量较高，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（438.37±23.68） mg/L，提取率达到60.65%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（596.39±32.73） mg/L，提取率达到62.43%（质量分数）；KDS沉淀法的提取量和提取率最低，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（278.57±17.02） mg/L，提取率为30.19%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（314.02±11.54） mg/L，提取率仅为32.87%（质量分数）。 因此，从蛋白质含量和提取率的比较结果可以看出，无水乙醇沉淀法和透析冻干法的效果较好，KDS法的提取效果最差。

2.2 SDS-PAGE分析提取的蓝莓酒蛋白质

3种方法提取的蛋白质质量检测和图谱分析分别见图1和表2。从图1、表2可以看出，提取蛋白质的相对分子质量分布在40～170 ku，但3种方法所获得的蛋白质在凝胶电泳中显示的条带数目、背景颜色以及清晰度均存在差异。无水乙醇沉淀的蛋白质条带最多、最清晰，背景颜色也较浅，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在100、70、20 ku左右，显示3条带，加酶黑莓酒的条带较多，蛋白质的分子质量多集中在40～170 ku，显示5条带；透析冻干法提取的蛋白质不纯，背景颜色很深，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在100 ku和70 ku左右，显示2条带，加酶黑莓酒的条带较多，蛋白质的相对分子质量多集中在40～170 ku，显示4条带；KDS法提取的蛋白质SDS-PAGE图谱中呈现的条带最少、最不清晰，加酶和未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量在70 ku和 20 ku左右，只显示2条带。果胶酶的条带多且集中，相对分子质量多集中在40～170 ku，与加酶黑莓酒中的条带较一致，说明在酿酒工艺的酶解过程中所添加的果胶酶是黑莓酒中的蛋白质的一个重要组成部分。从蛋白质的SDS-PAGE电泳结果来看，无水乙醇沉淀法提取的蛋白质的纯度最高，杂质最少；透析冻干法提取的蛋白质里的杂质较多；KDS法提取的蛋白质质量最差。

3 结论

本研究通过无水乙醇沉淀法、透析冻干法和KDS法提取黑莓酒中的蛋白质，对得到的总蛋白质样品进行定量和SDS-PAGE电泳检测，结果显示如下：

（1）蛋白质含量和提取率的分析结果显示，透析冻干法提取效果最高，无水乙醇法次之，，两者的提取率都在60%以上；KDS法的提取效果最差，提取率为30%左右。

（2）SDS-PAGE电泳显示黑莓果酒的蛋白质相对分子质量分布在40～170 ku，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在70～100 ku。在果酒的酿造过程中酶解处理会增加果酒中的蛋白质含量和蛋白质种类。

（3）无水乙醇沉淀法获得的蛋白质纯度最高，条带最清晰；冻干透析法获得的蛋白质，冻干后有很大一部分黏稠物不能复溶，杂质太多，虽然含量最高，但其背景颜色太深，条带不清晰；KDS法获得的蛋白质含量最低，条带最少，染色最弱，最不清晰。

样品制备是关键环节，直接影响后续的SDS-PAGE电泳效果，尤其针对黑莓果酒这样低蛋白质含量的原料，确定理想的蛋白质提取方法对蛋白质电泳非常重要。综合以上结果，确定无水乙醇沉淀法为黑莓果酒中总蛋白质提取的最适方法。

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