3种酸碱环境模拟方法的比较

刘龙昌　司卫杰　周红丽　王菲　陈然　周正军

摘要：比较研究NaOH/HCl法、磷酸缓冲液法和综合法不同酸碱环境模拟方法对确定适宜的方法具有重要意义。以白菜（Brassica rapa var. chinensis）为试验材料，研究NaOH/HCl法、磷酸缓冲液法和综合法对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明，不同模拟方法的萌发指数、活力指数、根长和苗长在所有pH值条件下均有极显著差异（P

关键词：pH值；酸碱环境；模拟方法；萌发指数；活力指数；根长；苗长；白菜

中图分类号： O655.22 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0426-06

在植物的生活史中，种子萌发和幼苗阶段是植物对环境胁迫忍耐力最小的阶段[1]。除了种子自身的健康状况、休眠等内部因素以外，种子能否顺利萌发出苗，还受到外界环境因子如温度、光照、pH值、土壤水分和盐分等的影响[2-3]，pH值是影响土壤养分形态和有效性的主要因素之一[4]。大多数植物适合在中性土壤中生长，pH值过高或过低都会影响种子萌发和幼苗生长[5]，也可能会使植物所需营养元素的生物有效性发生变化，进而导致植株某些营养元素失调[6]。pH值也可通过影响种子的蛋白水解酶活性或膜势能影响种子的萌发[7-8]。

在研究 pH 值对植物种子萌发和幼苗生长的影响时，不同研究者往往采用不同的方法模拟土壤的酸碱环境，目前涉及的模拟方法多达近10种[9-12]。按化合物种类和作用原理的不同，可将其可分为三大类：强酸碱法[13]、磷酸缓冲液法[3，14]、综合法，即不同 pH 值区段采用不同的缓冲溶液[2，15]。因所采用的化合物种类不同，上述各种模拟溶液中的离子类型和离子强度就会明显不同，不同模拟方法pH值的稳定性也会有一定差异。因此，从理论上来说，采用不同方法模拟的研究结果可能会有很大差异。但是，目前尚缺乏这方面的实证性研究报道。因此，本研究以白菜（Brassica rapa var. chinensis）为试验材料，对比研究3种常用方法的模拟效果，以期为确定适宜的模拟方法提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择对酸碱胁迫比较敏感的白菜为研究材料，挑选成熟度好且健康饱满的种子作试材。种子活力的测定采用氯化三苯四氮唑（TTC）法，经测定种子活力达95%以上。

1.2 种子萌发试验

用pH值分别为4、5、6、7、8 、9、10等7 个水平的模拟酸碱溶液为培养液，以蒸馏水为对照，进行种子萌发试验。各处理培养皿中初次加入约7 mL培养液浸湿滤纸，以后每天加入1～3 mL相同pH值的培养液以保持滤纸湿润。在试验过程中，每2 d更换1次滤纸，补充相同pH值培养液，以保持培养皿内pH值恒定。将培养皿置于人工智能培养箱培养，培养条件为：光暗周期12 h/12 h，光照度 250 μmol/（m2·s），温度25 ℃，每个处理水平均设4个重复。

采用2种种子预处理方法：（1）蒸馏水浸种处理。将白菜种子用1%次氯酸钠溶液消毒5 min，自来水冲洗5 min后用蒸馏水浸泡3 h，然后滤干种子。（2）培养液浸种处理。用各培养液浸泡3 h，其他处理同上。

1.3 3种酸碱模拟溶液的配制方法 （1）NaOH/HCl法。用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液将蒸馏水调配制pH值分别为4、5、6、7、8、9、10的溶液[16]。（2）磷酸缓冲液法。用0.2 mol/L NaH2PO4溶液和0.2 mol/L Na2HPO4溶液配制pH值分别为4、5、6、7、8、9、10的缓冲液[3，14]。（3）综合法。用2 mmol/L邻苯二甲酸氢钾与1 mol/L HCl配制成pH值为4的缓冲液；用2 mmol/L 2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）与 1 mol/L NaOH 配制pH值分别为5、6的缓冲液，用2 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 与1 mol/L NaOH 配制pH值分别为7、8的缓冲液，用2 mol/L N-三（羟甲基）甲基甘氨酸与1 mol/L NaOH配制pH值为9、10的缓冲液[2]。

1.4 数据处理及统计分析

发芽试验以胚根露出种皮 2 mm 作为萌发的标志，每 12 h 统计发芽数，连续12 h无种子发芽即结束发芽试验，并于试验后72 h测定根长和苗长。计算萌发率Gr、萌发指数Gi和活力指数Vi。其中：萌发率Gr=发芽种子数/试验种子数×100；萌发指数Gi=∑Gt/Dt（Gt为第t天时的萌发数，Dt为相应的萌发时间；活力指数Vi=S×∑Gt×Dt（S为幼苗的平均长度=根长+苗长）[11]。其中，萌发率和萌发指数为萌发参数；苗长、根长和活力指数为生长参数。

对种子萌发率等数据进行反正弦转换，采用SPSS 18.0软件包进行显著性检验、单因素方差（One Way ANOVA）分析和多重比较（LSD），用Excel 2003作图，研究结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 3种酸碱环境模拟方法对种子萌发的影响

表1显示，蒸馏水浸种时，不同模拟方法的萌发率虽有一定差异，但未呈现规律性变化，pH值为5、8、10时差异显著，其他pH条件下差异不显著；此时，所有pH值条件下的萌发指数均差异极显著；处理液浸种时，所有pH值条件（除了pH值为6的以外）下，不同模拟方法的2 个萌发参数差异显著或极显著，且这种差异主要存在磷酸缓冲液法与其他2种方法之间。用处理液浸种时，这种差异更大一些，2种浸种方法预处理后的试验结果相似，都是磷酸缓冲液法的最低。采用NaOH/HCl法时，pH值在4～10的条件下，2种浸种方法的萌发率均差异不显著，但处理液浸种的萌发指数显著或极显著低于蒸馏水浸种。蒸馏水浸种时，仅pH值为10的萌发率与对照差异显著（P<0.05），其他pH值条件下差异均不显著；pH值为5～7的萌发指数与pH值为9～10的差异显著，其他pH值条件下差异均不显著；用处理液浸种时，pH值为6的萌发率与对照十分接近，它们与pH值为5、7～9的萌发率差异不显著，与pH值为4、10的差异显著（Pendprint

从3种模拟方法的种子萌发进程（图1、图2）可知，磷酸缓冲液法的种子萌发率最低，萌发速度最慢。

2.2 3种酸碱环境模拟溶液对白菜种子活力指数及苗长、根长的影响

表2显示，pH值在4～10之间时，不同模拟方法的3 个生长参数差异均极显著，且这种差异主要存在于磷酸缓冲液法与其他2种方法之间。2种浸种法预处理后的试验结果也比较一致，都是磷酸缓冲液法最低。采用NaOH/HCl法时，2种浸种方法的苗长（pH值为4～10）、pH值为6～7的根长、pH值为6～8的活力指数差异均不显著，其他pH值条件下的处理液浸种的活力指数和根长均显著或极显著低于蒸馏水浸种。采用蒸馏水浸种时，pH值为5的活力指数与对照差异显著，其他pH值条件下差异均不显著，所有pH值条件下的根长、苗长与对照差异均不显著。采用处理液浸种时，pH值为6～7的活力指数与对照差异不显著，其他pH值条件下与对照差异显著或极显著；pH值为6～7的根长与对照差异显著，其他pH值条件下与对照差异极显著；pH值为4～10的苗长与对照差异均不显著。采用磷酸缓冲液法时，pH值在 4～10 的条件下，2种浸种方法的苗长差异均不显著；除中性（pH值为7）条件下的根长差异不显著外， 其他pH值条件下的根长和活力指数均差异显著，且均是处理液浸种的低于蒸馏水浸种的。同时，2种浸种方法的上述3个生长参数在所有pH值条件下均极显著低于对照。采用综合法时，2种浸种方法的苗长（pH值为4～9）、根长（pH值为6～7）、活力指数（pH值为5～7）差异均不显著，其他pH值条件下的处理液浸种的活力指数和根长均显著或极显著低于蒸馏水浸种。采用蒸馏水浸种时，pH值为5～7的活力指数和根长与对照差异不显著，其他pH条件下均差异显著或极显著；在pH值为 4～10 的条件下，苗长与对照差异均不显著。采用处理液浸种时，pH值为6的活力指数和根长与对照差异均不显著，其他pH值条件下差异显著或极显著；pH值为4～8时的苗长与对照差异不显著，仅pH值为9～10时差异极显著。

上述研究结果表明，磷酸缓冲液不仅对白菜种子萌发的抑制作用显著，而且对幼苗生长的抑制作用也显著，因而不宜作为酸碱环境的模拟方法。同时，综合种子萌发和幼苗生长2个阶段的研究结果不难看出，综合法模拟的结果更接近白菜种子对酸碱环境的适应情况。

3 结论与讨论

土壤pH值是影响种子萌发和幼苗生长的重要环境因子[17]，不同植物有不同的pH值适应范围。中性和偏酸性的环境有利于白菜种子萌发和幼苗生长，碱性和强酸性环境有显著抑制作用[18-19]。在本研究中，3种模拟方法在偏酸性和中性条件下的5 个参数值均最大（表1、表2）。研究结果进一步证实，中性和偏酸性的环境有利于白菜种子萌发和幼苗生长。

在强酸性或碱性条件下，NaOH/HCl法的各参数值仍然维持很高的水平，尤其在蒸馏水浸种时。而此时，综合法的各参数值却显著低于对照。在pH值为4～10的条件下，磷酸缓冲液法的各参数均远低于对照，且在大多数情况下，萌发的幼苗多为畸形苗或黄化苗。这表明磷酸缓冲液对白菜种子萌发和幼苗生长有明显的抑制和毒害作用，是最不适宜的模拟方法。综合法更接近白菜种子对酸碱环境的实际适应情况，是最佳方法。

因种子萌发所需的物质和能量主要依靠自身贮存的营养提供，加之有种皮的保护，所以相对于幼苗阶段，种子萌发阶段受不良环境的影响会小一些[13，20]。萌芽速度快的种子受到的影响会更小，尤其在吸足水分后。因为在不良环境产生的胁迫作用显现之前，种子已经完成了萌发过程。这应该是白菜种子萌发率在所有pH值条件下均很高的主要原因（磷酸缓冲液法除外），这种萌发情况显然与白菜的实际状况不相符。另外，在野外条件下，种子一开始就处于相应的酸碱环境中。因此，采用处理液浸种才能更好地反映种子对酸碱环境的实际适应能力。

采用NaOH/HCl和Na2HPO4/NaH2PO4等离子化合物模拟酸碱环境时，不仅pH值会对种子萌发和幼苗生长产生影响，而且这些化合物还可通过渗透效应和离子效应对种子产生盐胁迫[21-22]。有的研究表明，在盐迫害中起主要抑制作用的是渗透胁迫[23]；有的研究表明，起主要作用的是离子效应，尤其是Na+毒害作用[24]。过多的Na+会使相关代谢酶失活而对种子萌发和幼苗生长产生毒害作用[25-26]。一定浓度的磷酸根也会对种子萌发和幼苗生长产生明显的抑制作用[27]。在本研究中，NaOH和HCl的浓度为1 mol/L，而Na2HPO4和NaH2PO4浓度仅为0.2 mol/L。前者的离子浓度虽远高于后者，但是在所有pH值条件下，后者对白菜种子萌发和幼苗生长的抑制作用都远大于前者。由此可知，离子效应（尤其是磷酸根的存在）应该是白菜种子萌发和幼苗生长受到严重抑制的主要原因。采用综合法时，因各pH值区段使用的化合物浓度仅为2 mmol/L，并且各区段化合物均处于其最适缓冲范围内，所以调节pH值时使用的NaOH和HCl量也很小，加之使用的又多是非离子化合物（如HEPES）。因此，该方法的离子浓度远低于前2种方法，因大量离子的存在而引起的渗透效应和离子毒害也必然会小很多，这也应该是该方法模拟效果最好的主要原因。

在探讨pH值对种子萌发和幼苗生长的影响时，须要提供稳定的pH值环境。不同模拟方法的pH值稳定性往往不同，由于有同离子效应，缓冲液法的稳定性好于NaOH/HCl法。又由于综合法在不同pH值区段采用了处于最适缓冲范围的缓冲液，所以其pH值的稳定性（即缓冲效果）应该是最好的。无论是在处理液配制过程中，还是在种子萌发的过程中，NaOH/HCl溶液都容易发生pH值的跃变，这必然会影响研究结果的准确性，这也应该是该方法模拟效果不佳的主要原因之一。

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