环介导等温扩增技术的假阳性扩增研究

王德国，王永真，王爱萍

(1．许昌学院食品与生物工程学院，河南省博士后研发基地，河南许昌461000;2．许昌学院公共实验中心，河南 许昌461000;3．郑州大学生命科学学院，河南 郑州450000)

日本学者Notomi等2000年发明报道了环介导等温扩增技术［1］，据谷歌统计截至目前该报道已被引用2146次，该技术通过多对引物巧妙实现扩增，环介导等温扩增反应效率非常高，因为无温度变化的耗时，后来环引物的提出进一步缩短了反应时间［2］，因此环介导等温扩增在反应速度、特异性、灵敏度方面优于链式聚合酶反应(PCR)［3，4］、酸序列依赖性扩增(NASBA)［5，6］、链替代扩增反应(SDA)［7］、滚换扩增反应(RCA)［8］和解链酶扩增(HAD)［9］，然而，在科技成果快速转化的当今时代，环介导等温扩增技术经过十多年的研究开发，仍然没有实际应用，主要由于这种核酸扩增检测方法假阳性率高，本研究旨在研究分析引起假阳性扩增的主要原因，为环介导等温扩增技术的实际应用提供理论与实践基础．

按照Notomi等2000年所报道的试验设计引物，以相同的反应体系与扩增条件开展实验，而本实验结果与所报道的完全不同．

1 实验材料与方法

1．1 引物

采用Notomi等报道中针对M13的环介导等温扩增引物，由生物工程(上海)有限公司合成，如表1所示．

表1 环介导等温扩增引物

1．2 DNA 模板

实验室没有M13DNA模板，因此，在本研究中也就不存在模板引起的气溶胶污染及交叉污染问题．

1．3 环介导等温扩增反应

按照Notomi等报道的反应体系与反应条件进行扩增反应，只是所有的反应管中均不加DNA模板，加入不同引物组合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP;F3+B3)各种引物的浓度与Notomi等报道的相同，扩增后2%的琼脂糖凝胶电泳，重复三次．

2 结果与分析

如图1所示，其中四种引物组合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP)均能非特异扩增，并且具有典型的LAMP梯度条带，而Notomi等报道的试验中阴性对照没有扩增，并且没有典型的LAMP梯度条带［1］．

目前该领域的科研工作者普遍认为环介导等温扩增技术灵敏度高，容易产生气溶胶污染，交叉污染是导致假阳性率高的主要原因，在实现不开盖检测方面做了大量研究与尝试，如浊度法检测［10］、实时浊度法检测［11］、荧光染料检测［12-14］、免疫侧向层析试纸检测［15］、使用指示剂羟基萘酚蓝检测［16，17］以及日本荣研公司的钙黄绿素检测，扩增产物的检测手段近乎非常完美，但不开盖检测并没有把环介导等温扩增推向实际应用，正如本研究结果所表明的，引起环介导等温扩增假阳性的主要原因不是气溶胶污染，而是引物的非特异性扩增．环介导等温扩增通过多对引物实现巧妙扩增，使用多对引物难免会形成引物二聚体和出现非特异性扩增，特别是在环介导等温扩增反应中引物、镁离子、dNTP和酶的浓度比Real-time PCR中的高好几倍，在Real-time PCR研究中，为了避免非特性扩增需要严格控制这四个因素的浓度．在本研究中，甚至一对内引物就可以非特异性扩增，因此，目前环介导等温扩增技术只是理想的分子模型，在该技术的应用研究中应致力于解决非特异性扩增问题．

图1 不加模板的情况下环介导等温扩增结果

3 结论

环介导等温扩增技术推广应用的瓶颈是假阳性率高，导致假阳性率高的主要原因是引物二聚体引起的非特异性扩增，其次是气溶胶污染．本研究的创新之处在于首次发现限制环介导等温扩增技术推广应用的真正原因所在．

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