融合自组装双亲短肽提高碱性果胶酶热稳定性*

刘松，汪明星，堵国成，陈坚

1(工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

碱性果胶酶(PGL，E.C.4.2.2.2)是一种在碱性环境下具有高活性的一类果胶裂解酶，可以通过反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1，4-糖苷键并释放出不饱和的寡聚半乳糖醛酸［1］。基于其催化特性，PGL主要应用于纺织工业中的织物精炼过程。传统的精炼工艺是在高温强碱环境下去除织物中的果胶，该工艺能耗高，且废液对环境污染极大。在生物精炼工艺中，PGL可以高效去除织物中的果胶，节能减排效果明显［1］。此外，PGL还广泛应用于食品行业和造纸行业，如降解橄榄中的果胶提高出油率［2］、通过分解阴离子多糖果胶提高纸浆质量［3］。

复杂的应用环境如纺织精炼等对PGL在高温条件下的稳定性和催化活性提出了更高的要求［2］。目前主要通过菌株选育来获得高热稳定性的PGL，主要来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)［4］、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)［5］和部分芽孢杆菌［6］等。然而，已发现的耐热酶比酶活为9.9 ～35 U/mg［4-6］，远不能满足应用需求。此外，由于缺乏野生菌PGL高效发酵策略，这些来源的热稳定PGL难以实现工业化生产。因此，提高已实现高产的重组PGL的热稳定性和催化活性，具有重要应用前景和现实意义。

近年来，基于蛋白质工程的方法已广泛用于酶催化性能的改造。然而，传统的蛋白质工程技术，如定点突变、随机突变和饱和突变等，高度依赖于酶分子晶体结构分析或建立高通量的突变体筛选平台［7］。这些局限性使得研究者难以在短时间内获得理想的酶突变体。作者在前期工作中，首次发现N-端融合酿酒酵母Zuotin蛋白［8］等来源的6种自组装双亲短肽(SAP)，使脂肪氧合酶的55℃半衰期提高2.3～4.5倍，同时其比酶活亦显著提升［9］。该分子改造策略一个显著特点是，无需深入了解酶分子的结构信息和建立高通量筛选平台，较传统技术更高效。目前，这种融合SAP的分子改造技术已广泛应用于环糊精葡萄糖基转移酶［10］、腈水合酶［11］和碱性淀粉酶［12］等酶的热稳定性或催化活性改造。

在前期研究中，作者将Bacillus sp.WSHB04-02 PGL成功能表达于毕赤酵母，PGL产量达到1 593 U/mL［13］。为进一步提高酶的热稳定性，将6种SAP融合至Bacillus PGL的N-端，获得了热稳定性和比酶活均有提高的PGL。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

E.coli JM109，E.coli BL21(DE3)，Bacillus sp.WSHB04-02和pET-22b(+)均为本实验保存。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶Nco I、Nde I和Xho I均购自Ther-mo公司，DNA定点突变试剂盒MutanBEST Kit、Primer star DNA聚合酶、胶回收试剂盒、DNA连接酶、感受态制备试剂盒和琼脂糖均购于TaKaRa公司。异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、质粒提取试剂盒与氨苄青霉素均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;胰蛋白胨与酵母粉购自Oxoid公司;NuPAGE®Novex® Bis-Tris预制凝胶购自Life Technologies公司;考马斯亮蓝染色液G250/R250和标准分子质量蛋白均购自碧云天生物技术研究所;聚半乳糖醛酸(PGA)购自Sigma公司;其他常规试剂均为分析纯，都是进口分装或者国产。

1.1.3 培养基

LB培养基:酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。TB培养基:酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，pH 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 PGL与SAP融合表达质粒的构建

6个SAP的编码基因由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，并分别在其5’端和3’端引入6×Histag和PT linker基因。将带有融合标签和PT linker的短肽DNA克隆至质粒pET-22b(+)的Nde I和Nco I位点之间，得到含SAP的表达质粒，pET-22b(+)/S1，pET-22b(+)/S2，pET-22b(+)/S3，pET-22b(+)/S4，pET-22b(+)/S5和pET-22b(+)/S6。利用引物P1和P2(表2)经PCR扩增得到的Bacillus sp.WSHB04-02 PGL基因，分别克隆至上述含SAP表达载体的Nco I和Xho I，得到PGL与SAP融合表达的载体。

表1 SAP氨基酸序列及结构特点Table 1 Amino acid sequences and characteristics of SAPs

表2 PGL基因扩增引物序列Table 2 Primer sequences for PGL gene amplification

1.2.2 重组菌发酵

重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)得到表达PGL融合酶的重组菌。

种子培养:将重组菌接种于LB培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素，2%葡萄糖)，于37℃、200 r/min摇床上振荡培养10 h。

摇瓶发酵:种子液以体积分数3%的接种量接入TB培养基(100 μg/mL氨苄青霉素)，于37℃、200 r/min培养至菌体浓度OD600=0.6，加入终浓度0.04 mmol/L IPTG于30℃下诱导48 h。

1.2.3 PGL的纯化

取发酵液于8 000 r/min离心10 min，获得含PGL的发酵上清液。将上清液置于冰上，缓慢加入硫酸铵粉末，至终质量分数为20.9%，离心收集上清液。将样品用0.25 μmol/L微孔滤膜过滤，所得样品用5 mL苯基疏水柱(HiTrapTMPhenyl FF，GE)进行纯化。柱纯化条件如下:用5～10倍柱体积的缓冲液A(20 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，质量分数20.9%硫酸铵，pH 7.5)平衡疏水柱，之后以1 mL/min的流速进样;进样结束，用5个柱体积的A液继续冲平柱子;流速改为3 mL/min，分别以0～100%的洗脱缓冲液B(20 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 7.5)进行线性洗脱。取测得PGL酶活的洗脱液在20 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5)中过夜透析，4℃保存。

1.2.4 PGL酶活测定

PGL酶活测定体系:含0.2%PGA的甘氨酸-NaOH 缓冲液(0.2 mol/L，0.44 mmol/L 的 CaCl2，pH 9.4)2 mL，待测样品20 μL，无活性的酶液为空白对照。PGL酶活测定条件:将反应体系置于45℃下水浴15 min，用3 mL磷酸溶液(0.03 mol/L)终止反应，在235 nm处测定吸光度值。PGL酶活单位定义:单位时间裂解PGA产生1 μmol/L不饱和PGA所用的酶量。计算方法如下:

式中:PGL酶活力单位为U/mL;b，比色皿厚度，cm;4 600，不饱和PGA于235 nm处的摩尔吸光系数，L/(mol·cm);t，酶促反应时间，min。

1.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析

采用 Life Technologies公司预制胶 NuPAGE®Novex® Bis-Tris，具体操作方法见使用说明书。使用浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，以0.1%考马斯亮蓝R-250进行染色。

1.2.6 蛋白浓度测定

采用碧云天的Bradford蛋白浓度测定试剂盒，具体操作详见使用说明书。基于纯酶的蛋白浓度和酶活，测定PGL及SAP-PGL融合酶的比酶活。

1.2.7 PGL最适反应温度与半衰期的测定

重组 PGL 及突变体在45、50、55、60、65 和 70 ℃进行酶催化反应，测PGL在不同温度条件下的酶活力，确定其最适反应温度。

重组PGL及突变体的热稳定性用55℃下酶活力半衰期(t1/2，min)来表示。将纯化后的PGL用20 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5)稀释至100 μg/mL，并在55℃保温，间隔测定残余酶活，将残余酶活按照文献所述方式拟合并计算t1/2［14］。

1.2.8 PGL最适反应pH的测定

在不同pH下按照标准方法测定酶活力，以处理前酶活定为100%。按2.2.4所示方法，将反应pH调为8.6～10.6不等的5个梯度，30℃下保温24 h，测PGL在不同pH条件下的酶活力，考察其最适反应pH。

1.2.9 PGL催化动力学常数的测定

在0.05～2 g/L不等的PGA浓度下，按照2.2.4所示方法测定不同底物浓度下的酶活，并由Graph-Pad Prism 5计算得到Km和kcat。

1.2.10 PGL结构分析

利用PIC在线服务器(http://pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html)计算SAP及SAP-PGL氢键作用、盐桥数量、疏水作用等。

2 结果与讨论

2.1 SAP-PGL融合酶的制备

SAP是一类由亲疏水性氨基酸残基交替排列而成的短肽，它能在特定条件下自发组装成有序的纳米结构。本研究选取了6种SAP用于制备SAP-PGL融合酶(表1)。其中，SAP-1和SAP-2分别源自Zuotin蛋 白［15］和 Carnobacterium maltaromaticum CP5［16］，SAP-3、SAP-4、SAP5 和 SAP6 由 Lazar等设计［17］。为避免PGL主体结构受SAP的影响而丧失催化活性，本研究利用最常用的蛋白质linker—PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPT)将SAP连接至Bacillus PGL的N-端，并在SAP的N-端融合亲合纯化标签His-tag以便进行亲和纯化(图1)。将构建得到的6种融合酶的表达质粒转化E.coli BL21(DE3)表达。SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4、SAP-5和 SAP-6 与 LOX 融合分别得到融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL。

图1 SAP-LOX融合表达质粒的构建Fig.1 Construction of the SAP-PGL fusion plasmids

取含有融合酶的发酵上清液进行分离纯化。尽管融合酶N-端含有His-Tag，但是除S1-PGL之外的其他5种融合酶与Ni2+亲和层析柱的结合效率低，无法进行亲和纯化。这可能是由于5种融合酶的His-Tag被包埋于酶蛋白分子内部而无法与Ni2+亲和层析柱有效作用［9］。因此，采用苯基疏水柱对融合酶进行纯化。在线性洗脱条件下，天然酶PGL在30%～40%无盐缓冲液中被洗脱，而SAP-PGL融合酶则在50%～70%无盐缓冲液被洗脱。这些现象表明，PGL在融合SAP表面疏水度进一步增强。上述含酶的洗脱液经过夜透析得到电泳纯样品(图2)。

图2 SAP-PGL融合酶的SDS-PAGE蛋白电泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified SAP-PGL fusions

2.2 融合SAP对PGL热稳定性的影响

为比较PGL与SAP-PGL的热稳定性，测定了纯化后的PGL及SAP-PGL融合酶55℃半衰期t1/2(表3)。结果显示，融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL 和 S6-PGL 分别较 PGL t1/2提高 16、43、72、15、23和9倍。其中，S3-PGL的55℃ t1/2达到21.53 h，表现出极高的热稳定性。同时，除S2-PGL之外，其他5种SAP-PGL的最适反应温度均较PGL提高5℃。目前，关于分子改造提高PGL热稳定性的报道较少。Xiao等［18］采用一种基于熔解温度导向型的序列比对(Melting-Temperature-Guided Sequence Alignment)的定点突变策略，得到的黄单胞菌(Xanthomonas campestris)PGL突变体R236F在45℃的t1/2达到21.25 h，较野生酶提高23倍。很显然，本研究得到S3-PGL较X.campestris PGL突变体R236F具有更高的热稳定性。上述结果表明，融合SAP能显著提高PGL的热稳定性。

表3 SAP-PGL融合酶的55℃半衰期与最适反应温度Table 3 The t1/2values of SAP-PGL fusions at 55℃

2.3 融合SAP对PGL催化活性的影响

为进一步分析融合SAP对PGL催化活性的影响，以PGA为底物测定了SAP-PGL融合酶的催化动力学常数和比酶活，结果如表4所示。与PGL相比，SAP-PGL融合酶的Km均略有提高，表明融合SAP降低了PGL与底物PGA的亲和力。S1-PGL、S2-PGL和S5-PGL的kcat较SAP提高超过50%，其他融合酶kcat增加不明显或有所下降。与SAP相比，S1-PGL的kcat/Km和比酶活分别提高3.52倍和2.56倍，表明融合SAP-1提高了PGL底物专一性和催化效率。然而，其余5种融合酶的kcat/Km和比酶活均显著下降。目前，从自然界筛选得到的高热稳定性PGL中，如B.licheniformis［4］、Bacillus sp strain P-4-N［6］和 T.maritime MSB8［5］等，比酶活仅为9.9 ～35 U/mg，严重制约了其应用价值。尽管Xiao等［18］通过分子改造提高了PGL的热稳定性，但其比酶活未见显著增长，仅为208 U/mg。本研究获得的S1-PGL t1/2(55℃)和比酶活分别达到6.16 h和458.52 U/mg，具有理想的应用性能。

表4 突变体酶学常数Table 4 Kinetic constants of SAP-PGL fusions

2.4 融合SAP对PGL最适反应pH的影响

PGL主要用于织物前处理等碱性应用环境，故分析了SAP-PGL的最适反应pH。将突变体分别置于pH 9.0～10.6的4种缓冲液中，测定其反应活性。如图3所示，S1-PGL、S2-PGL和S3-PGL与PGL的最适反应pH一致，S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL最适反应pH提升至10.6(图3)。因此，所有SAP-PGL融合酶最适反应pH均在碱性范围内，符合其工业应用环境要求。

图3 pH对SAP-PGL催化活性的影响Fig.3 The effect of pH on the activities of SAP-PGL fusions

2.5 融合SAP提高PGL热稳定性和催化活性的机制

一般认为，短肽融合提高酶分子稳定性的机制主要有两种:分子局部刚性的增加［19］和酶分子的寡聚化作用［9］。Takano等发现 C-端短肽(IGCIILT)主要通过增加氢键、二硫键和疏水相互作用增强S.tokodaii RNase HI C-端刚性［19］。前期研究中，作者通过动态光散射分析观察到融合SAP使脂肪氧合酶的粒径增加，表明融合酶存在一定的寡聚化，而寡聚化是多亚基蛋白稳定化的重要方式［20］。在凝胶过滤色谱分析过程中，未能见到SAP-PGL多聚体分子的出现(结果未显示)，表明SAP-PGL不是通过寡聚化作用来获得高热稳定性的。本研究利用PIC在线服务器分析了SAP-PGL融合酶分子内作用力变化(表5)。结果显示，除S6-PGL之外，各融合酶中的疏水相互作用有一定程度增加。此外，S1-PGL、S2-PGL、S5-PGL和S6-PGL分子中的氢键较PGL增加3个、3个、2和5个。因此，分子内作用的增加可能是SAP-PGL融合酶热稳定提高的重要原因。SAP-3、SAP-5和SAP-6是由不同linker连接两个相同SAP序列得到的短肽(表1)，短肽柔性依次提高［9］。如表3所示，S3-PGL、S5-PGL和S6-PGL的热稳定性依次下降，表明高柔性的SAP不利于酶热稳定性的提高。

与PGL相比，仅有S1-PGL的比酶活显著提高，其他融合酶的比酶活则明显下降。融合短肽的长度可能是影响其催化活性的重要原因之一。如表1所示，双亲短肽SAP-1由16个氨基酸残基组成，而其他5条 SAP的氨基酸残基分别超过40个［9］。因此，SAP-1融合至PGL后可能形成的空间位阻相对较少，对底物和产物出入酶催化活性中心的影响较小，融合较长短肽则造成较大的影响。S1-PGL的kcat明显高于PGL及其他融合酶，而其Km并未在较水平。这表明S1-PGL比酶活的提高主要是由于底物转换数的增加。关于S1-PGL比酶活提高的机制还有待其晶体结构的解析。

表5 PGL及其SAP-PGL融合酶分子内作用力分析Table 5 Interactions potentially involved in the stability of PGL and SAP-PGL fusions

3 结束语

关于 PGL高效生产已有大量报道，芽孢杆菌［21-22］和毕赤酵母［13］等是主要的生产菌株。然而，PGL应用性能(如热稳定性、催化活性等)优化方面的研究较少，对其应用的推广造成不利影响。为提高PGL热稳定性，本研究考察了N-端融合自组装双亲短肽(SAP)对PGL热稳定性的影响。将6种具有不同疏水性和柔性的SAP融合至Bacillus sp.WSHB04-02 PGL N-端，得到融合酶 S1-PGL、S2-PGL、S3-PGL、S4-PGL、S5-PGL和S6-PGL。与 PGL相比，融合酶的55℃半衰期(t1/2)提高9.69～72.03倍。其中，PGLS1比酶活达458.52 U/mL，较PGL提高1.5倍;其他融合酶比酶活则较PGL下降38.27% ～93.94%。上述结果表明，N-端融合SAP能有效提高PGL热稳定性和催化活性。本研究得到的具有高热稳定性和高催化活性S1-PGL具有突出的应用前景。然而，末端融合SAP提高酶分子稳定性的机制尚无明确结论和直接证据。在下一步工作中，将通过晶体结构解析揭示S1-PGL稳定化的分子机制，为基于融合SAP的酶分子改造策略的广泛应用奠定基础。

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