美拉德反应对金带细鲹鱼肉蛋白酶解物功能特性及潜在危害物形成的影响*

王军，王忠合，傅力，卢彬

1(韩山师范学院生命科学与食品科技学院，广东潮州，521041)

2(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐，830052)

金带细鲹(Selaroides leptolepis)为鲹科细鲹属的鱼类，俗名木叶鲹，为近海暖水性鱼类，产于南海、台湾海峡。其富含蛋白质、氨基酸和维生素，营养价值较高［1］。

糖基化是近年来食品蛋白质改性中的一种很有前途的方法，可以充分利用蛋白质的表面性能(空气/水或油/水界面的吸附能力)与还原糖较好的持水、增稠性能，改善蛋白质或多肽的抗氧化性、溶解性、乳化性和质构等方面的改性［1-2］。但是美拉德类糖基化反应也有很多的不足，如产生有毒和致畸化合物、褐变、营养丢失及反应时间长等［3-5］。本文以金带细鲹鱼肉蛋白酶解物为原料，研究了不同温度(100、120℃)下美拉德修饰反应对酶解物功能特性及5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺等潜在危害物形成的影响，以期为鱼肉蛋白酶解物的修饰与安全控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金带细鲹:购于当地市场，去除鱼头和内脏，洗净沥干后用搅碎机搅成肉糜，用保鲜袋分装(每袋100 g)后，贮存于-20℃冰箱备用;大豆色拉油，购于当地超市;胰蛋白酶(4 000 U/g)，广东恒凯生物试剂有限公司;胃蛋白酶(3000～3 500 NFU/mg)、胰酶(5×USP)、亚硝基铁氰化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)，生工生物工程(上海)有限公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)、丙烯酰胺、5-羟甲基糠醛、甲酸、甲醇、L-亮氨酸，美国Sigma公司;葡萄糖、三氯乙酸、铁氰化钾、FeCl3、FeCl2、乙醇、水杨酸钠、NaClO、H3PO4等。

UV-2800型紫外可见分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司;FD-1D-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;2-16 P型离心机，美国Sigma公司;PHSJ-4A型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司;DF-101S型恒温加热磁力搅拌器，天津予华仪器有限公司;DE-100LB型高剪切分散乳化机，南通克莱尔混合设备有限公司;Waters Sep-pak C18固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司;Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent 1200型UV/Visible检测器、Eclipse XDB-C18型色谱柱，均为安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼肉蛋白酶解物的制备

取鱼糜按质量比1∶3与水混合后，调节溶液pH和温度至胰蛋白酶的最适条件(pH为7.0，温度为50℃)，加入1%的胰蛋白酶(E/S=1∶100)酶解30 min后取样，100℃灭酶10 min，将酶解液于10 000 r/min下离心10 min，取上清液冷冻干燥，备用。采用TNBS法［6］测得鱼肉蛋白酶解物的水解度为10.8%。

1.2.2 酶解物美拉德反应产物的制备

将酶解物用蒸馏水配制成浓度为25 mg/mL的溶液，按酶解物与葡萄糖质量比1∶2加入葡萄糖，再用1 mol/L NaOH调节pH至9.0，取20 mL置于具塞密闭试管中，分别在100 ℃，120 ℃下反应0、1、2、3、4、5、6 h(MRPs-100、MRPs-120 分别表示 100、120 ℃下的反应产物)。反应后，立即取出置于冰水浴中冷却至室温，测定pH值，然后置于-18℃冷冻备用。同时按上述试验条件，以不加葡萄糖的作为对照(对照-100、对照-120分别表示在100、120℃下的反应产物)。

1.2.3 美拉德反应进程分析

A294和A420:反应样液用蒸馏水稀释100倍和50倍，以蒸馏水做参比，分别在294 nm和420 nm下测定吸光度［7］。

游离氨基含量的测定:采用TNBS法［6］。

1.2.4 美拉德反应潜在危害物的测定

5-羟甲基糠醛(HMF):根据 Rufián-Henares［8］的方法，略作修改。将样品过0.45 μm滤膜后，用高效液相色谱法测量，色谱条件:Agilent Eclipse XDB-C18型色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱温 30 ℃，流动相为90%水+10%甲醇，流速为1.0 mL/min，检测波长280 nm，进样体积20 μL。使用外标法绘制标准曲线，质量浓度梯度为:9.94、29.83、49.72、69.61、89.50 μg/mL。以峰面积(y)和5-羟甲基糠醛质量浓度(x)作标准曲线，标准曲线方程为:y=0.079 5x+0.021 5，R2=0.999 7。色谱图如图1所示。

图1 5-羟甲基糠醛(HMF)的标准液质色谱图Fig.1 LC-MS chromatograms for determination of 5-hydroxymethylfurfural(HMF)

丙烯酰胺(AA):根据文献［9］的方法，略作修改。取1 mL样液以1滴/s加入固相萃取柱(使用前依次用1 mL甲醇和1 mL水活化)中，收集除第1滴外的流出液，用氮气吹干后再用1 mL水溶解，过0.45 μm滤膜后用高效液相色谱系统测定含量。色谱条件:Agilent 1200型高效液相系统，Agilent Eclipse XDB-C18型色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱温20 ℃，流动相为水-甲醇(体积比90∶10)，流速为1.0 mL/min，检测波长210 nm，进样体积15 μL。质谱条件:阳离子电喷雾电离源(ESI+)，质谱扫描方式为多反应监测(Multiple Reaction Monitor，MRM)方式，毛细管电压1.0 kV，锥孔电压20 V;离子源温度110℃;射频透镜1(RF Lens 1)的电压为30.8 V;脱溶剂气温度400℃，脱溶剂气流量600 L/h;锥孔气流量50 L/h;碰撞室入口电压2.0 V，出口电压3 V;碰撞能量20 eV;碰撞腔真空度2.2×10-3Torr。监测离子为AA母离子m/z 71.7，子离子 m/z 54.8;定量离子为 AA m/z 54.8。以峰面积(y)与丙烯酰胺的质量浓度(x)作标准曲线，标准曲线方程为:y=0.122 5x+0.283 3，R2=0.995 2。以保留时间和各对离子的响应强度的比例作为定性标准。其液质色谱图见图2。

图2 丙烯酰胺液质色谱图Fig.2 LC-MS chromatograms for determination of acrylamide

1.2.5 功能特性分析

溶解性:取0.2 g样品与20 mL蒸馏水混合，用1.0 mol/L的NaOH溶液或1.0 mol/L的HCl调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30 ℃水浴下搅拌30 min(搅拌过程中测定并保持pH)，于6 000 r/min的转速离心20 min，采用微量凯氏定氮法消化-水杨酸比色法［10］测定上清液中蛋白质的含量，根据总蛋白的含量计算蛋白质的溶解性，结果表示为上清液中蛋白浓度占相应的总蛋白浓度的百分比。

乳化性及乳化稳定性的测定:采用经典的比浊法［11］测定乳化特性。取0.018 g样品与1.8 mL去离子水混合，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液将pH 调为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。加入 0.6 mL大豆色拉油，经高速搅拌器于10 000 r/min下处理1 min，分别在搅拌后0 min和10 min时从测试管底部取样50 μL，与5.0 mL 0.1%SDS溶液混匀，在波长500 nm处测定吸光度，以0.1%SDS溶液作空白。乳化性指数(EAI，m2/g)和乳化稳定性指数(ESI，min)的计算公式［11］如下:

式中:DF，稀释倍数，DF=100;C，样品质量浓度，g/mL;φ，光程，φ =1 cm;θ，乳液中油相所占比例，θ=0.25;A0，0 min 时测定的吸光度;A10，10 min 时测定的吸光度。

体外消化性:取反应3 h的样液20 mL，用0.02 mol/L HCl调至pH 2.0，加入1 mL胃蛋白酶液(E/S=1/250)，37℃水浴中体外模拟胃液消化处理2 h，取样采用微量凯氏定氮法消化-水杨酸比色法［10］测定蛋白质的含量;其余部分用1 mol/L NaOH溶液将pH调至7.0，装入透析袋(截留分子质量10 ku)中，再加入1 mL胰酶(E/S=1/50)，将其置于装有100 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中进行体外模拟肠液消化2 h，每隔0.5 h收集消化产物，采用微量凯氏定氮法消化-水杨酸比色法［10］测定蛋白质的含量，按公式(3)［12］计算样品的体外消化率DR。

式中:S为上清液中的蛋白质含量，μg;T为样品中的蛋白质总量，μg。

1.3 数据分析

实验重复测定3次，结果表示为平均值±标准偏差SD。数据统计分析采用SPSS 17.0软件进行一维方差分析(one-way ANOVA)，差异显著性采用Duncan(邓肯)检验，检验水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 美拉德反应进程分析

2.1.1 pH值的变化

由图3可知，反应体系MRPs-100和MRPs-120的pH值随着反应时间的延长而逐渐降低，且MRPs-120的pH值在前4 h急剧降低，4 h后pH值下降趋于平缓。pH值的降低主要是因为美拉德反应过程中糖和酶解物受热发生降解生成甲酸和乙酸等酸性物质，以及反应消耗了氨基酸等物质［13］。而对照组的pH值无显著变化(P＞0.05)。

图3 反应体系pH的变化Fig.3 Change of pH value in reaction system

2.1.2 A294nm和A420nm的变化

294 nm和420 nm处的吸光度值分别是美拉德反应中间阶段和高级阶段的评定指标之一，酶解物与葡萄糖的反应体系中A294nm和A420nm随温度和时间的变化如图4所示。

图4 反应体系A294(a)和A420(b)的变化Fig.4 Change of A294(a)and A420(b)in reaction system

由图4可知，随着反应时间的增加MRPs-120和MRPs-100两体系的 A294nm和 A420nm显著增加，且MRPs-120的吸光度增加趋势远高于MRPs-100的吸光度增加趋势(P＜0.05)，此结果与 Yilmaz等［14］的研究结果一致，这表明反应温度对体系色泽的影响较大。两个对照组的A294nm无明显变化，而A420nm略有升高，这可能是由于鱼肉酶解物中含有少量的还原糖，加热导致还原糖的焦糖化反应或者糖与肽之间的美拉德反应而形成有色物质。

2.1.3 游离氨基的变化

由图5可知，反应最初2 h游离氨基的含量迅速下降，2 h后游离氨基的含量变化不显著(P＞0.05)，反应2 h时MRPs-120的游离氨基的损失速率是MRPs-100的2.88倍。在美拉德反应的初期阶段，肽类或者蛋白质的α-氨基和赖氨酸残基的ε-氨基与葡萄糖的羰基发生反应，造成这些高活性游离氨基大量减少，而其他氨基难以被利用，因而加热处理后期游离氨基含量变化不明显［15］。同时，美拉德反应会降低反应体系的pH值，pH下降反而会降低反应底物的反应活性［13］，因而反应进行到一定阶段时，参与美拉德反应的游离氨基数减少。而对照组中游离氨基的含量无显著变化(P＞0.05)。

图5 反应体系中游离氨基含量的变化Fig.5 Change of content of free amino group in reaction system

2.2 功能特性分析

2.2.1 溶解性的变化

由图6可知，鱼肉酶解物经美拉德反应修饰后其溶解度显著增加(P＜0.05)，而对照组样品的溶解度变化不大，这可能是因为酶解物与亲水性的葡萄糖结合引入了具有亲水性的羟基，改善了样品与水分子之间的亲和力，从而提高了反应产物的溶解度［16］。同时，MRPs-120的溶解度显著高于相同条件下MRPs-100的溶解度，MRPs-120的溶解度最高达到97.95%，这说明一定程度的加热处理有助于提高酶解物的溶解度。

图6 美拉德反应对酶解物溶解度的影响Fig.6 Effect of Maillard reaction on solubility of hydrolysates

2.2.2 乳化性及乳化稳定性的变化

如图7所示，在实验的pH范围内所有样品具有较好的乳化活性，且MRPs的乳化活性比各对照组的乳化活性显著提高(P＜0.05)，MRPs-120的乳化活性最高，达到361 m2/g。由于葡萄糖具有亲水性，与酶解物糖基化后，使其产物的表面活性增大，从而提高了MRPs的乳化活性。糖基化反应在一定程度上可提高酶解物的乳化稳定性，而加热处理影响样品乳化稳定性的变化规律不明显，短时间的热处理可提高酶解物的乳化稳定性，但是长时间的热处理又不利于其乳化稳定性，这说明酶解物样品形成乳化分散体系的能力方面和稳定乳化分散体系方面不存在相关性。

图7 美拉德反应对酶解物的乳化性(a)及乳化稳定性(b)的影响Fig.7 Effect of temperature and pH on emulsifying activity index(a)and emulsion stability index(b)MRPs and hydrolysates

2.2.3 体外消化性的变化

从图8可知，在0～120 min模拟胃液消化阶段，所有样品的体外消化速度较快，对照-120的体外消化率均高于其他样品，这可能是由于经120℃热处理导致蛋白质或肽分子解链胃蛋白酶作用位点暴露，体外消化率随之提高。而糖基化产物在模拟胃液中的消化水解程度较小，这主要是由于胃蛋白酶属于肽链内切酶，其专一性程度较大，主要作用于芳香族氨基酸的羧基基团形成的肽键［12］，而无法降解糖基化接枝反应形成的修饰产物。在120～240 min模拟肠液消化阶段，酶解物及其美拉德反应修饰产物在胰酶作用下的消化率逐渐增加，其中对照-120酶解物的体外消化率仍高于其他样品，在240 min时体外消化率达到了89.29%。美拉德反应产物在模拟肠液中的消化速率降低，也可能是由于美拉德反应产物抑制了消化酶的活力而降低了消化性［17］。

图8 美拉德反应对酶解物体外消化性的影响Fig.8 Effect of Maillard reaction on in vitro digestibility of hydrolysates

2.3 美拉德反应潜在危害物的变化

2.3.1 5-羟甲基糠醛(HMF)的变化

5-羟甲基糠醛(HMF)是美拉德反应的中间产物之一，常用于评价美拉德反应进行的程度，主要是在食品加热的过程中由糖类物质直接脱水形成，除了温度条件外HMF的形成还取决于食品中糖的种类、pH值、水分活度和媒介物二价阳离子的浓度等因素的作用［17］。由表1可知，随着反应时间的延长，MRPs-120中HMF含量呈现逐渐增加的趋势，反应6 h时HMF含量达到了32.94 μg/mL，是 MRPs-100的 82倍，而MRPs-100仅在反应6 h时检测到微量的HMF存在。随着反应时间的延长，对照-120中HMF的含量也呈现略微增加的趋势，在反应6 h时含量为0.94 μg/mL，这可能是因为酶解物中含有少量糖脱水形成。对照-100在整个反应过程中未检测出HMF存在，这表明反应温度是反应过程中形成HMF的关键因素，这与Ajandouz等人研究发现的焦糖化反应在较高的反应温度或碱性pH条件下容易发生的结论一致［13］。

表1 美拉德反应对HMF含量的影响 单位:μg/mLTable 1 Effect of Maillard reaction on HMF content

2.3.2 丙烯酰胺的变化

如表2所示，随着反应时间的延长，MRPs-100中丙烯酰胺含量随着反应时间的延长而逐渐增加，反应6 h后达到10.64 μg/mL;MRPs-120中丙烯酰胺的含量呈先增加后趋缓的趋势，这可能是由于形成的丙烯酰胺进一步参与了反应而降解;对照-120和对照-100中测出含有微量的丙烯酰胺，且随着反应时间的延长其含量逐渐积累。丙烯酰胺是一种具有神经毒性的小分子化合物，在食品加工过程中主要由天冬酰胺通过美拉德反应形成，对人类健康具有潜在的危害性，因而在采用美拉德反应修饰蛋白酶解物的过程中要尽量避免不必要的长时间高温加热，以减少丙烯酰胺的形成。

表2 美拉德反应对丙烯酰胺含量的影响 单位:μg/mLTable 2 Effect of Maillard reaction on acrylamide content

3 结论

(1)美拉德反应的过程中，A294nm、A420nm急剧增加，MRPs-120的pH值和游离氨基的含量与MRPs-100相比显著降低(P＜0.05)，而对照组无显著变化(P ＞0.05)。

(2)功能特性研究表明，与未糖基化的酶解物相比，美拉德修饰反应提高了其溶解度、乳化活性及乳化稳定性，而体外消化率显著降低。

(3)随着反应时间的延长，MRPs中HMF和丙烯酰胺的含量逐渐增大，而对照-100中未检出HMF的存在。

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