一株产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素特性研究

一株产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素特性研究

黎 杰，韩 磊，殷文政*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018)

摘要[目的] 研究从酸马奶酒中筛选出的1株产细菌素的乳酸菌的细菌素特性。[方法]从内蒙古地区酸马奶酒中分离到19株乳酸菌，采用牛津杯双层平板扩散法，排除有机酸、过氧化氢的干扰后，经蛋白酶敏感性试验，筛选出1株产细菌素的乳酸菌菌株XMD6。[结果]通过形态学特征、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析，鉴定为坚强肠球菌(E.durans)。其所产细菌素在80 ℃对热稳定，显示抑菌活性pH范围为2～7。抑菌谱试验表明，该菌能抑制食品中常见的革兰氏阳性、革兰氏阴性的致病菌及腐败菌，具有较广的抑菌谱。[结论]研究可为今后开发利用新型细菌素防腐剂提供理论依据。

关键词乳酸菌；筛选；细菌素；特性

中图分类号S879.1

基金项目内蒙古自然科学

作者简介黎杰(1988-)，男，重庆人，硕士研究生，研究方向：食品科学。*

收稿日期2015-06-03

Screening of Bacteriocin-producing Lactic Acid Bacteria and the Characteristics of Bacteriocin

LI Jie, HAN Lei, YIN Wen-zheng*(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

Abstract[Objective] To study bacteriocin characteristics of lactic acid bacteria isolated from koumiss. [Method] Nineteen strains of lactic acid bacteria were isolated from koumiss in Inner Mongolia region. Through the Oxford cup double agar diffusion method, after eliminating the interference of organic acids and hydrogen peroxidea. Screening one strain of bacteriocin producing lactic acid bacteria strain XMD6 by the protease sensitivity test. [Result] The lactic acid bacteria was identified as E.durans by morphological, physiological and biochemical method and 16S rRNA gene sequence homology analysis. The bacteriocin of strain XMD6 heat-stable at 80 ℃, and pH in the range of 2-7 have antibacterial activity. The inhibitory spectrum test showed that it can inhibit the gram positive and gram negative pathogenic bacteria and spoilage bacteria in food, has a wider antibacterial spectrum. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of new type bacteriocin preservative.

Key wordsLactic acid bacteria; Screening; Bacteriocin; Characteristics

细菌素(bacteriocin)是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的蛋白质或多肽[1-2]，能抑制食品中的多数腐败菌和致病菌的生长繁殖[3]。化学防腐剂的乱用、滥用会在人体内毒素蓄积，而细菌素可被人体内蛋白酶降解，无任何残留，无毒副作用，也不会产生抗药性，是公认的天然食品防腐剂[4-5]。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是被证明了的食品安全级微生物(GRAS)，其发酵过程中产生有机酸、过氧化氢、细菌素等多种代谢产物。其中乳酸菌细菌素因其安全、无毒且有较强的抑菌活性，作为食品防腐剂具有广阔的应用前景和市场价值，已成为国内外开发研究的热点。在食品工业中应用乳酸菌细菌素替代化学防腐剂，将有利于改善食品安全现状。目前为止，乳酸链球菌素(Nisin)是唯一允许作为防腐剂在食品生产加工中使用的细菌素，已在60多个国家和地区广泛用于乳制品、肉制品、罐装食品等的防腐保鲜中[6]。但Nisin的抑菌谱较窄，对pH的稳定性较差[7-8]，因而，Nisin在食品中应用范围受到一定程度的限制。笔者从酸马奶酒中筛选出1株产细菌素的乳酸菌，并对细菌素的特性进行初步研究，为今后开发利用新型细菌素防腐剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品。采集自内蒙古锡林郭勒地区以传统方法自然发酵的酸马奶酒。

1.1.2指示菌。肠沙门氏菌亚种、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；大肠杆菌购于美国典型菌种保藏中心(ATCC)；金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；单核细胞增生李斯特氏菌，购于中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)；酿酒酵母、热带假丝酵母、黑曲霉，均由内蒙古农业大学微生物实验室保藏。

1.1.3培养基。脱脂乳培养基、生理生化试验培养基参照文献[3，9]配制。MRS培养基、NA培养基、NB培养基、YPD培养基、PDA培养基，购于北京路桥技术有限公司。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的分离、纯化与保存。采用平板划线法，对酸马奶酒样品中乳酸菌进行分离和纯化，选取纯菌株进行革兰氏染色镜检及过氧化氢酶试验，并将菌株于4 ℃保存备用。

1.2.2发酵上清液的制备。乳酸菌连续传代培养3代，发酵液在4 ℃，8 000 r/min离心20 min，上清液用0.45 μm滤菌器过滤除去菌体，收集发酵上清液。

1.2.3抑菌试验。采用牛津杯双层平板扩散法[10]。具体方法为：在灭菌的平皿中注入约10 ml 2%的琼脂培养基，使均匀铺满平皿底部作为下层，冷却后在表面等间距放置灭菌的牛津杯，待NA培养基冷却到50 ℃左右时，取200 μl指示菌菌悬液加入到20 ml培养基中，混匀后倒入下层有琼脂的平皿中，待上层培养基冷却后再将牛津杯取出，制成带孔的含菌平板。将180 μl乳酸菌发酵上清液注入到小孔内，室温下扩散4 h，在37 ℃恒温培养12 h，取出后用游标卡尺测定抑菌圈直径。抑菌试验均重复3次。

1.2.4产抑菌物质乳酸菌的初筛。以沙门氏菌为指示菌，测定乳酸菌发酵上清液的抑菌活性。选取产生明显抑菌圈的菌株进行复筛。

1.2.5产细菌素乳酸菌的复筛。有机酸的排除：将发酵上清液调pH至5.0，以用乙酸、乳酸调相同pH的MRS液体培养基对照组，对沙门氏菌抑菌试验。

过氧化氢的排除：发酵上清液pH调至7.0，按浓度为10 mg/ml加入过氧化氢酶，37 ℃水浴2 h，再调回pH至5.0，以未加过氧化氢酶处理pH 5.0的发酵上清液作对照，进行抑菌试验。

酶敏感性试验：将发酵上清液分别调到各蛋白酶的最适pH 2.0、7.6、7.6、6.0和6.5，按终浓度1 mg/ml对应加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和溶菌酶，在37 ℃水浴锅中温育2 h，再调回对照pH 5.0。以未用蛋白酶处理的pH 5.0发酵上清液作对照组，进行抑菌试验。

1.2.6产细菌素乳酸菌的鉴定。形态学特征：观察记录乳酸菌的菌落特征及细胞形态。生理生化试验：生理生化试验参照文献[11-13]的方法进行。16S rRNA基因序列分析：用细菌基因组DNA提取试剂盒对乳酸菌的基因组DNA进行提取，以其为模板进行PCR扩增16S rRNA基因序列。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶检测，并送上海生工进行测序。将所测16S rRNA基因序列在提交到NCBI，用BLAST工具进行序列的同源性分析，并通过MEGA5.2软件构建系统发育树。

1.2.7细菌素的热稳定性。将发酵上清液pH调至5.0，分别在40、60、80、100、121 ℃条件下加热处理30 min，以未加热处理的发酵液作对照，做抑菌试验。

1.2.8细菌素对pH的稳定性。用2 mol/L的HCl和2 mol/L的NaOH将发酵上清液的pH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。分别测定不同pH下细菌素对指示菌的抑菌活性。

1.2.9抑菌谱的测定。发酵上清液pH调至5.0，分别对沙门氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、酿酒酵母、热带假丝酵母和黑曲霉做抑菌试验，确定细菌素的抑菌谱。

2结果与分析

2.1乳酸菌的分离从酸马奶酒中分离得到19株菌株，均革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶试验呈阴性，可初步判定为乳酸菌。

2.2产抑菌物质乳酸菌的初筛通过抑菌试验，有4株乳酸菌的发酵上清液对沙门氏菌有明显抑制作用，结果见表1。

表1　产抑菌物质乳酸菌初筛结果　mm

注：表中数值为3次试验的平均值±标准误差；牛津杯直径8 mm。

2.3产细菌素乳酸菌的复筛对4株产抑菌物质乳酸菌进行复筛，通过排除有机酸、过氧化氢的干扰及酶敏感性试验，筛选出1株产细菌素的乳酸菌，复筛结果如表2所示。

表2　乳酸菌XMD6的复筛结果　mm

注：表中数值为3次试验的平均值±标准误差；“-”，无抑菌圈；牛津杯直径8 mm。

由表2可知，pH 5.0时，乙酸、乳酸对沙门氏菌均无抑制作用，发酵上清液的抑菌圈减小，仍有较强抑菌作用，表明有机酸有一定的抑制作用，但不是主要抑菌物质。过氧化氢酶处理的发酵上清液抑菌圈直径基本没变化，可排除过氧化氢的作用。发酵上清液经胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后，其抑菌活性部分或完全丧失，说明发酵上清液中的主要抑菌物质是蛋白类物质，可初步确认为细菌素。

2.4产细菌素乳酸菌的鉴定

2.4.1形态学特征。菌株XMD6的菌落呈圆形、乳白色、大小0.5～2.0 mm、边缘整齐、表面光滑、质地均匀、有光泽、凸起、不透明。细胞形态为革兰氏阳性球菌，呈圆形或椭圆，单个或成簇排列。

2.4.2生理生化试验。乳酸菌XMD6的生理生化试验结果见表3。由表3可知，菌株XMD6能发酵葡萄糖不产气，10 ℃和45 ℃生长，在pH 9.6和6.5%NaCl也能生长，0.1%美兰还原，不能发酵阿拉伯糖、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、鼠李糖和蔗糖。根据《伯杰氏系统细菌学手册》[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[13]可初步鉴定为坚强肠球菌(Enterococcusdurans)。

表3　乳酸菌XMD6生理生化试验结果

注：“+”，90%以上菌株为阳性；“-”，90%以上菌株为阴性；“d”，11%～89%菌株为阳性。

2.4.316S rRNA基因序列分析。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)。由图1可知，PCR扩增产物得到一条清晰的条带，大小约1 500 bp。

将菌株XMD6测得的 16S rRNA基因序列与GenBank中已知菌株的基因序列进行同源性比较，并构建系统发育树(图2)。由图2可知，菌株XMD6与标准菌株Enterococcusduransstrain DSM 20633的同源性最高，达到100%。结合生理生化试验及16S rRNA基因序列分析，该菌为坚强肠球菌(Enterococcusdurans)，命名为E.duransXMD6。

2.5细菌素的热稳定性发酵上清液经不同温度处理后的抑菌结果见表4。由表4可知，E.duransXMD6产的细菌素在经80 ℃处理30 min后，抑菌圈大小基本不变，121 ℃处理30 min，仍有抑菌活性，可以判定该细菌素具有良好的热稳定性。

表4　不同温度对细菌素抑菌活性的影响　mm

注：表中数值为3次试验的平均值±标准误差；牛津杯直径8 mm。

2.6细菌素的pH稳定性不同pH对发酵上清液抑菌活性的影响结果如图3所示。由图3可以看出，E.duransXMD6产的细菌素在pH 2～7的范围内有抑菌活性，其抑菌活性随pH的升高而逐渐降低，pH在8～11范围内无抑菌活性，说明E.duransXMD6产的细菌素酸性条件下有较好的稳定性。

2.7抑菌谱的测定发酵上清液对11株指示菌的抑菌结果如表5所示。由表5可知，E.duransXMD6产的细菌素能抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌以及沙门氏菌、大肠杆菌革兰氏等革兰氏阴性细菌，具有广谱抑菌作用。

表5　细菌素的抑菌谱

注：“+++”，直径>15 mm；“++”，11 mm<直径<15 mm；“+”，8 mm<直径<11 mm ；“-”，无抑菌圈。

3结论

该研究从酸马奶酒中分离出19株乳酸菌，排除有机酸、过氧化氢的干扰后，经蛋白酶敏感性试验，筛选出1株产细菌素的乳酸菌菌株XMD6。结合形态学特征、生理生化反应及16S rRNA基因序列分析，将其鉴定为Enterococcusdurans，并命名为E.duransXMD6。

目前，已发现的乳酸菌细菌素有300多种，其产生菌株集中在乳球菌属、片球菌属、乳杆菌属、肠球菌属等[14-16]。肠球菌属中以屎肠球菌研究最多[17]，坚强肠球菌产细菌素还未见报道。E.duransXMD6产的细菌素对蛋白酶敏感，有良好的热稳定性，80 ℃处理30 min抑菌活性基本不变，可用于巴氏杀菌食品的生产加工中，具有广阔的应用前景。此外，E.duransXMD6产的细菌素在pH 2～7的范围内显示抑菌活性，抑菌活性随pH增大而降低，这可能是因为高酸性条件可促进细菌素的抑菌活性或细菌素和酸共同的作用，有待继续研究，因此，可将其用于酸性食品的防腐保鲜中。一般情况下，细菌素只能抑制同种或亲缘关系很近的细菌，而该试验筛选的E.duransXMD6产的细菌素，对食品中常见的革

兰氏阳性和阴性腐败菌及致病菌都有很好的抑制效果，具有较广的抑菌谱。

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