左归丸胚胎期干预对GDM大鼠子代发生IGT的影响

王悦尧，王永辉，许凯霞，柴 智，李艳彦，周 然

（1.成都中医药大学，四川成都611137； 2.山西中医学院，山西太原030024）

左归丸胚胎期干预对GDM大鼠子代发生IGT的影响

王悦尧1，王永辉2，许凯霞2，柴 智2，李艳彦2，周 然2

（1.成都中医药大学，四川成都611137； 2.山西中医学院，山西太原030024）

目的：研究左归丸胚胎期干预能否对妊娠糖尿病（GDM）大鼠子代高糖高脂饮食诱发的糖耐量减低（IGT）起到预防作用。方法：育龄雌性SD大鼠受孕后随机分为正常对照组、妊娠糖尿组、胰岛素组、左归丸组、联合干预组。受孕当日妊娠糖尿病组和3个干预组按45 mg/kg腹腔内注射链尿佐菌素（STZ），复制妊娠糖尿病模型。并于孕4 d~19 d给药干预（左归丸10 g/kg灌胃，胰岛素20 IU/kg皮下注射）。孕鼠产子后，每窝取1只雄鼠，组成新组，组别不变。母乳喂养3 w，普通生长饲料喂养2 w，除正常对照组外，其余各组子鼠均于6 w龄开始高糖高脂饮食。10 w后葡萄糖干化学法测各组子鼠空腹血糖（FPG）、糖负荷后2 h血糖（P2hG），全自动生化仪测血脂，酶联免疫法测脂联素浓度，并进行HE染色观察肝脏的病理形态。结果：15 w龄末，模型组子鼠发生IGT；与正常对照组比较，妊娠糖尿病组TC、TG显著升高，HDL-C、APN显著降低，药物干预组可以改善相关指标，联合用药组优于单用药物组。结论：糖尿病大鼠妊娠期予补肾阴方左归丸干预能够有预防高糖高脂饮食引发子代成年大鼠发生IGT。

左归丸；妊娠糖尿病；IGT；脂联素

糖耐量低减（IGT）是介于正常糖耐量与糖尿病之间的一种糖代谢异常状态，属糖尿病前期阶段。目前全世界约有3.08亿人患IGT［1］，IGT人群发展为糖尿病的可能性与正常人群相比高6倍，总体死亡率高1.48倍［2］，故IGT的干预工作越来越受到重视。大量研究证明，IGT的发生是多因素综合作用的结果，这些因素大致包括了先天遗传因素和后天影响机体能量代谢的因素。遗传因素构成了个体对后天那些能够影响机体能量代谢的因素的易感性，而多种后天因素则通过多种信号转导机制干扰机体能量代谢系统的不同元件和环节并激活与之相应的基因活性，成为IGT发生的外部诱因。课题组前期采用补肾方药于胚胎发育期给药，发现补肾阴方左归丸可以有效预防高脂饲料引发子代成年大鼠IGT的发生。本实验在前期研究的基础上，复制先天不良因素刺激（宫内高糖）加后天不良生活习惯（高糖高脂喂养）的模型，并在胚胎期进行干预，观察左归丸是否可以预防子代大鼠IGT的发生。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康的生育期SD雌性大鼠（10 w龄，体重220 g～260 g），雄性大鼠（12 w龄，体重300 g～340 g）。许可证号SCXK（京）2009-0017，由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.2 药物与试剂 左归丸（河南省宛西制药股份有限公司，国药准字Z41020696）；诺和灵R笔芯（诺和诺德，国药准字J20121010）；STZ（Sigma公司，批号040M1357）；柠檬酸（C6H8O7·H2O）、柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）（天津市科密欧化学试剂公司）；葡萄糖氧化酶法试剂盒（批号1403282）、大鼠脂联素酶联免疫定量检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号1411271）。

1.1.3 实验饲料 配方：酪蛋白（23.3%）、淀粉（8.5%）、糊精（11.7%）、蔗糖（20.1%）、纤维素（5.8%）、豆油（2.9%）、猪油（20.7%）、胱氨酸（0.4%）、多矿（1.2%）、CaHPO4（1.5%）、CaCO3（0.6%）、多维（1.2%）、柠檬酸钾（1.9%）、酒石酸胆碱（0.2%），总能：4 730 kJ/kg。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证编号SCXK（京）0219363，2004-0008。

1.1.4 实验仪器 罗氏乐康全活力型血糖测定仪（德国罗氏诊断有限公司）、YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、电子秤（国产，MP200-1）、电子分析天平（德国，A210P）、常温台式离心机（日本，Kubota2100）、烘箱（杭州卓驰有限公司）、酶标仪（美国伯乐Bio-rad imark）、自动生化分析仪（日本，01ympusAU400）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 适应性饲养1 w后，开始实验。雌鼠禁食不禁水12 h，剪尾取血测空腹血糖，血糖值≤6.1 mmol/L作为纳入标准。以雌、雄比例2∶1合笼过夜，次晨雌鼠阴道涂片镜检见精子者，定为受孕。将孕鼠随机分5组，每组10只，即正常对照组、妊娠糖尿病组、胰岛素干预组（胰岛素组）、左归丸干预组（左归丸组）、左归丸联合胰岛素干预组（联合干预组）。除正常对照组外，其余4组于受孕当日禁食12 h后，经腹腔注射链脲佐菌素（STZ）45 mg/kg，特异性损伤胰岛β细胞，复制妊娠糖尿病模型。正常对照组腹腔内注射柠檬酸缓冲液。于妊娠第3天测孕鼠血糖，若血糖值≥l6.7 mmol/L，则建模成功。药物干预组孕鼠于妊娠第3天开始给药：左归丸按10 g/kg体重灌胃，胰岛素按20 IU/kg皮下注射，1次/d，至孕19 d。正常对照组和妊娠糖尿病组灌胃蒸馏水，1次/d。孕20 d～22 d孕鼠分娩产子。各组子鼠均每窝随机取1只雄鼠，组成新组，组别不变。各组子鼠由正常母鼠喂养3 w，普通生长饲料喂养4 w～5 w，6 w龄开始，正常对照组子鼠常规饲料喂养，其余各组子鼠高糖高脂饲料喂养。参考赵宝珍等［3］对糖耐量受损大鼠的检测方法，每周对子代大鼠做1次糖耐量试验。实验过程中，大鼠置于12 h/12 h明暗循环，自由饮食，温度25℃、湿度50%～60%条件下饲养。1.2.2 指标检测 采用1999年世界卫生组织（WHO）糖尿病诊断标准：糖负荷试验后2 h血糖（P2hG）在7.8～11.1 mmol/L时诊断为IGT。15 w龄末，禁食不禁水12 h，剪尾测空腹血糖FPG，后予50%葡萄糖注射液灌胃，2 g/kg，2 h后再次剪尾采血，测P2hG。模型组平均P2hG达IGT标准时，各组动物隔夜禁食12 h，以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，用自动生化分析仪检测血脂；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测脂联素浓度，采用上海西唐生物科技有限公司提供的ELISA数据处理软件。所有大鼠肝脏组织固定后送至中国辐射防护研究院动物研究所进行常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察形态学改变情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所得结果用均数±标准差（x±s）表示。各组间均数比较应用单因素方差分析（one-way ANOVA）。该数据资料为完全随机设计资料，呈正态分布，经方差齐性分析后，两组之间的比较选择LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 左归丸胚胎期干预对子代大鼠FPG、P2hG、APN的影响

正常对照组、妊娠糖尿病组、胰岛素组、左归丸组、联合干预组空腹血糖相互比较差异无统计学意义。妊娠糖尿病组P2hG显著高于正常对照组（P＜0.01），胰岛素组、左归丸组、联合干预组P2hG低于妊娠糖尿病组（P＜0.01，P＜0.05）。妊娠糖尿病组APN低于正常对照组（P＜0.01），联合干预组APN高于妊娠糖尿病组（P＜0.05）。结果见表1。

2.2 左归丸胚胎期干预对子代大鼠血脂的影响

妊娠糖尿病组TC、TG显著高于正常对照组（P＜0.05），胰岛素组和联合用药组TC、TG低于妊娠糖尿病组（P＜0.05）；妊娠糖尿病组HDL-C较正常对照组显著降低（P＜0.01），胰岛素组、左归丸组、联合干预组HDL-C高于妊娠糖尿病组（P＜0.01）。结果见表2。

表1 左归丸胚胎期干预对子代大鼠FPG、P2hG、APN的影响 （x±s）

表2 左归丸胚胎期干预对子代大鼠血脂的影响 （mmol/L，x±s）

2.3 对子代大鼠肝脏病理形态的影响

正常对照组肝细胞肝小叶结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状分布，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，未见脂滴沉积。妊娠糖尿病组肝细胞肿胀，部分肝细胞呈气球样变，多数肝细胞内可见大小不等，数量不一的脂滴空泡，一些肝细胞核则被脂肪滴挤得明显偏位，肝索排列紊乱，偶有点状坏死。与妊娠糖尿病组相比，左归丸组和胰岛素组肝脏脂肪变有不同程度的减轻，脂滴数量减少，脂滴变小，细胞及小叶结构不同程度恢复，表明胚胎期的干预对子代大鼠的肝脂肪变性有一定的预防作用。联合干预组肝组织结构基本趋于正常，肝索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列明显恢复整齐，轮廓和细胞分界也较其他几组清晰；无明显脂肪空泡现象，细胞核圆，胞质丰富，但中央静脉中间仍可见少量淤血，结果见图1。

3 讨论

本课题在造模时，复制了宫内高糖环境模型，以期观察妊娠糖尿病对子代发生IGT是否有影响，妊娠期给予药物干预是否可以起到预防作用。实验结果显示，子代大鼠经高糖高脂饲料喂养10 w后，模型组（妊娠糖尿病组）子代大鼠糖负荷试验平均血糖水平已达到IGT的诊断标准，这比许凯霞等［4］用高脂饲料诱发正常妊娠大鼠的子代发生IGT的时间要早2 w，推测可能与妊娠大鼠宫内高糖环境有关。并且模型组的TC与TG显著高于正常妊娠组，APN与HDL-C低于正常妊娠组，提示在IGT发生的同时，血脂、脂联素等亦发生伴随改变。药物干预组的相关指标较模型组有明显改善，联合用药的效果要优于单用胰岛素或左归丸，提示两者在改善相关指标方面具有协同作用。

在本实验中，左归丸对妊娠糖尿病大鼠子代发生IGT的预防作用可以从祖国医学和现代医学两方面进行解释。

糖尿病在祖国医学中称之为消渴病。中医认为多饮、多食、多尿、消瘦的产生，多与肺燥、胃热、肾虚有关［5］。然而治疗上虽有肺燥、胃热、肾虚之异，但发病根本在肾，肾阴亏虚是糖尿病发病的实质，治宜注重滋阴补肾。IGT属于糖尿病前期，故可以从消渴的病因病机上来认识。胚胎期予补肾阴方左归丸一方面顾及了孕鼠在妊娠期间阴血下聚以荫胎致其阴血之不足的生理特点，从而有利于胚胎在其腹中有充足的物质基础，是中医“补母益子”论的体现；另一方面，既然糖尿病是以阴虚为本，燥热为标，则可认为IGT也类似，通过补其母之真阴，则药物可通过胎盘间接影响胚胎发育，在胎儿期补真阴，可充实先天之本，增强后天之免疫力［6］。

现代医学认为，2型糖尿病（T2DM）是一种复杂遗传病，95%是由遗传、环境、行为多种因素共同参与、相互作用引起的多基因-多因子病［7］。遗传因素决定了个体对糖尿病的易感性，而多种环境因素可能是诱发糖尿病发生的外部原因。由于遗传因素在T2DM的发病过程中占主要地位，因此，如何在胚胎发育期阻断糖尿病遗传的发生途径，成为当前研究的一个热点。

图1 对子代大鼠肝脏病理形态的影响（HE×200）

健康与疾病的发展起源（Developmental origins of health and disease，DOHD）学说认为胎儿对宫内不良环境的反应使其自身代谢和器官组织结构发生适应性调节，如果不良因素得不到及时纠正，这种适应性调节将导致包括血管、胰腺、肝、肺等机体组织和器官在代谢结构上发生永久性改变，进而演变为成人期的疾病［8］。这一漫长“程序化”发育改变可被诸多后天环境因素放大，从而加速成人疾病的发展过程。大量的流行病学研究已经证实，几乎所有的慢性疾病都与生命早期的环境存在一定的相关性；受到成人不良生活方式影响的疾病如胰岛素抵抗、2型糖尿病、脂肪代谢异常、肥胖、高血压和心血管疾病在胎儿期即被程序化，即生命早期的环境导致的机体结构或功能变化或在基因修饰水平上发生了永久变化。许凯霞等［6］已发现补肾方胚胎期干预可以提高子代大鼠脂联素的mRNA表达，而脂联素是脂肪组织所表达和分泌的多种产物中与胰岛素抵抗关系最紧密的一个特异性细胞因子，是胰岛素抵抗的保护因子。其可以抑制肝脏脂肪合成、促进脂肪氧化分解、减轻餐后血清游离脂肪酸（FFA）的升高，增强周围组织对胰岛素的敏感性，抑制炎症因子产生，从而阻断IGT的形成与进展。本实验中左归丸和胰岛素干预组的APN值高于模型组，联合干预组的APN值则显著高于模型组，推测药物干预组对APN的影响可能是影响IGT发病的机制之一。

在我国相当一部分地区，作为糖尿病的后备军——糖耐量受损的人群超过了糖尿病患者的数量［9］。近年来，流行病学资料显示IGT的发病呈逐年增长趋势且年轻化。IGT人群发生DM的危险明显高于非IGT人群，而且心血管病变的发生机制早在IGT阶段已启动。因此，对糖尿病前期患者进行有效的干预，延缓或阻断糖尿病前期向DM转变，降低DM及其慢性并发症的发生率，对改善人们的生活质量、提高健康水平、节约卫生资源有着重大意义［10］。

［1］Grant S J，Bensoussan A，Chang D，et al.Chinese herbal medicines for people with impaired glucose tolerance or impaired fasting blood glucose［J］.Cochrane Database Syst Rev，2009，7（4）：1 002-1 006.

［2］Alberti K G，Zimmet P，Shaw J．International diabetes federation：a consensus on type 2 diabetes prevention［J］.Diabete Med，2007，24（3）：451-463.

［3］赵宝珍，谢晓云，张晓瑞.糖耐量受损大鼠血清脂联素瘦素与冠状动脉病变的关系［J］.中国药物与临床，2006，6（6）：408-410.

［4］许凯霞，王永辉，杨向竹，等.补肾方胚胎期干预子代成年大鼠IGT及其胰岛素抵抗、瘦素抵抗的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：167-171.

［5］王静，王庆，王珍贞，等.中医不同治法对四氧嘧啶糖尿病模型大鼠的降糖作用［J］.中西医结合学报，2010，8（8）：781-784.

［6］许凯霞，王永辉，杨向竹，等.补肾方胚胎期干预预防子代成年大鼠IGT及其脂联素异常的实验研究［J］.山西中医学院学报，2013，14（2）：27-29.

［7］许凯霞.从基因水平探讨补肾中药预防糖尿病的机理［J］.现代中医药，2013，33（3）：64-66.

［8］Kikuchi T，Uchiyama M.Epidemiological studies of the developmental origins of the adult health and disease in Japan：a pediatric perspective in present day［J］.Clin Pediatr Endocrinol，2010，19（4）：83-90.

［9］许樟荣.护士在糖尿病教育和管理中承担着重大责任［J］.中华护理杂志，2004，39（10）：727-729.

［10］赵铁耘，李秀钧.糖尿病整治研究新理念［J］.中国实用内科杂志，2005，25（4）：302-304.

（编辑：翟春涛）

临床研究与经验

Clinic Research and Experience

西医断病，中医辨证，两者似乎截然不同。但如果戴上分子医学的眼镜，你就会发现证原来是寓于病之中的。从病识证，揭示了一条分子诊断和分子治疗的新途径。

Influence of Zuogui Pill on IGT′s intervention occurred embryonic rats of GDM

Wang Yueyao1，Wang Yonghui2，Xu Kaixia2，Chai Zhi2，Li Yanyan2，Zhou Ran2
（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu Sichuan 611137；2.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：To study the preventive effect of Zuogui Pill on rats with GDM offspring induced by high-fat diet. Methods：Pregnant reproduction SD rats were randomly divided into normal pregnancy group，GDM control group，diabetes insulin treated group，Zuogui Pill treated group，Zuogui Pill combined with insulin treated group.Sreptozotocin（STZ）were injected in rats abdomen so as to induce GDM model in GDM control group and the three treated groups.GDM control group and the three treated groups were prevented by drug respectively.After offsrings were born，a male mouse were taken to form a new group.The mice were given breastfeeding 3 weeks and general growth of diet 2 weeks.Except normal control group，other groups were given the high fat diet after 6 weeks.FPG and P2hG were measured by dry chemical measurement of glucose，blood lipids were measured by ACA，adiponectin concentration were measured by ELISA and liver pathomorphism were stained by HE and observed.Results：At the end of 15 weeks，IGT model were occurred in the model group offspring.Compared with the normal group，model group TC，TG significantly increased，HDL-C，APN significantly reduce.Conclusions：Zuogui Pill prevention in the period of diabete rats pregancy has the prevention offspring adult rats effect of occurrence of IGT induced by high-sugar and high-fat diet in adult rats

Zuogui pill；gestational diabetes；IGT；adiponectin

R285.5

A

1671-0258（2015）01-0030-04

山西省科技厅科研创新重点团队建设项目（2012081018）；山西省国际科技合作项目（2012081055-2）

王悦尧，在读博士，E-mail：wangyueyaoys@126.com

王永辉，博士，副教授，硕士研究生导师，E-mail：wyh766188@sina.com