丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子－4α表达的影响

丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子-4α表达的影响

侯丽娜陈程1刘东慧宋成军陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子(HNF)-4α表达的影响。 方法雄性SD大鼠48只随机分为：正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组，每组12只大鼠。链脲佐菌素连续腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型，待模型成功建立后，模型组大鼠不做任何处理，丝胶治疗组大鼠给予2.4 g·kg-1·d-1的丝胶连续灌胃35 d；丝胶预防组大鼠在链脲佐菌素连续腹腔注射前，给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃，时间与丝胶治疗组相同。分别采用Western 印迹法和RT-PCR法检测大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达。 结果与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达明显升高(P<0.01)；与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达明显降低(P<0.01)。结论丝胶改善糖代谢的作用可能与其调节肝脏HNF-4α的表达有关。

关键词〔〕丝胶；2型糖尿病；肝脏；肝细胞核因子-4α

中图分类号〔〕R587〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：陈志宏(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治方面的研究。

Effects of sericin on hepatocyte nuclear factor 4 alpha expression in liver of diabetes mellitus rats

HOU Li-Na,CHEN Cheng,LIU Dong-Hui,etal.

Department of Human Anatomy,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of sericin on hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4α) expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats model.Methods48 male SD rats were randomly divided into the following 4 groups:normal control,diabetes model,sericin treatment and sericin prevention groups (n=12).The type 2 diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin.After successfully establishing the diabetes animal models,the rats in diabetes model group were not given any more treatments.Rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1).Rats in sericin prevention group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) before injecting streptozotocin.Western blot and RT-PCR were used to detect the HNF-4α protein and mRNA expression in liver.ResultsThe HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in model group were obviously higher than those of normal control group (P<0.01).The HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in sericin treatment group and sericin prevention group were obviously lower than those of model group (P<0.01).ConclusionsThe effects of sericin on improving glucose metabolism may be associated with its down-regulating the HNF-4α expression in liver.

【Key words】Sericin;Type 2 diabetes mellitus;Liver;Hepatocyte nuclear factor 4 alpha

1天津医科大学

第一作者：侯丽娜(1986-)，女，硕士，主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治方面的研究。

肝细胞核因子(HNF)家族成员，包括肝细胞核因子-4α(HNF-4α)、HNF-1α、HNF-6、HNF-3α和HNF-3β等基因，这些基因的突变与青少年成人发病型糖尿病(MODY)的发生密切相关，其中编码HNF-4α的基因突变可导致MODY1，主要表现为胰岛素分泌缺陷〔1〕。HNF-4α是核受体超家族配基激活型转录因子的高度保守成员之一，属孤受体范畴〔2〕；HNF-4α具有脂溶性激素受体的特性，能够直接进入胞核发挥调节肝脏、胰岛代谢相关基因的表达〔3〕。HNF-4α在肝脏表达水平较高，可通过调节肝糖异生、葡萄糖摄取以及糖酵解等途径参与血糖调节，有研究表明，2型糖尿病大鼠肝脏HNF-4α的表达水平显著升高〔4〕。本研究拟观察丝胶对2型糖尿病模型大鼠肝脏HNF-4α表达的影响及可能机制。

1材料与方法

1.1试剂和药品丝胶，彩色蚕茧(承德医学院蚕业研究所)浸泡24 h后水煎2次，过滤并浓缩至所需浓度。链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司，用pH=4.4的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配成2%的溶液，临用时配制。兔抗HNF-4α多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；Trizol，美国Invitrogen公司；HNF-4α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2动物分组、处理和取材

1.2.1大鼠分组和处理清洁级SD大鼠48只，健康雄性，同批购自河北医科大学实验动物中心(712024)，体重200~250 g。大鼠适应性喂养1 w后随机分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组、丝胶预防组，每组12只。糖尿病模型组、丝胶治疗组以25 mg/kg的STZ于大鼠腹腔连续注射3 d制造2型糖尿病动物模型，每天监测各组大鼠血糖，以注射STZ 7 d后大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L为模型成立。模型成功建立后，模型组大鼠不再做任何处理；丝胶治疗组大鼠给予2.4 g·kg-1·d-1的丝胶连续灌胃35 d。丝胶预防组大鼠在同等剂量STZ连续腹腔注射前，给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d。

1.2.2取材各组大鼠分别于用药结束后以4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦取血，3 000 r/min离心后分离血清，-20℃保存备用。大鼠取血后断头处死，迅速取出肝脏，放入液氮中保存备用。

1.3检测血糖采用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠的血糖。

1.4大鼠肝脏HNF-4α表达的检测

1.4.1Western 印迹法检测HNF-4α蛋白取30 mg液氮保存的肝脏匀浆提取蛋白，二喹林甲酸(BCA)蛋白试剂盒定量蛋白浓度，取50 μg蛋白于8%浓缩胶和12%分离胶电泳后，4℃、2 Ma/cm2转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗(HNF-4α 1:200，β-actin 1∶1 000)室温2 h，二抗(1∶5 000)室温1 h，Super ECL Plus超敏发光液显影后扫描胶片，采用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以HNF-4α条带与β-actin条带的灰度比值作为HNF-4α蛋白的相对表达水平。

1.4.2 RT-PCR法检测HNF-4α mRNA取100 mg液氮保存肝脏组织，提取总RNA。取3 μg总RNA为模板反转录成cDNA，反应条件为：42℃孵育3 min；加入反应液Mix，42℃孵育15 min；99℃反应3 min。PCR反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循环。PCR引物序列及扩增条件见表1。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄片，并用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以HNF-4α条带吸光度与β-actin条带吸光度的比值，作为HNF-4α mRNA的相对表达水平。

表1　PCR引物序列及扩增条件

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2结果

2.1各组大鼠的血糖与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠的血糖水平明显升高(P<0.01)；与糖尿病模型组比较，丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠的血糖水平明显降低(P<0.01)。见表2。

表2　各组大鼠的血糖水平和肝脏HNF-4α的

与糖尿病模型组比较：1)P<0.01

2.2各组大鼠肝脏HNF-4α的表达Western 印迹结果(见图1)：HNF-4α条带位于蛋白分子量50 kD水平处，β-actin条带位于43 kD水平处；RT-PCR结果(见图2)：HNF-4α mRNA条带位于300 bp处，β-actin mRNA条带位于452 bp处。HNF-4α蛋白及mRNA的定量分析结果见表2：与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠HNF-4α蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.01)，丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肝脏HNF-4α蛋白及mRNA的表达较糖尿病模型组明显降低(P<0.01)。

1.正常对照组；2.糖尿病模型组；3.丝胶治疗组；4.丝胶预防组，下图同 图1　Western 印迹法检测大鼠肝脏HNF-4α蛋白的表达

图2　RT-PCR法检测大鼠肝脏HNF-4α mRNA的表达

3讨论

目前，治疗糖尿病多采用一些化学合成的药物，如二甲双胍、氯磺丙脲、拜糖平等。据文献报道，这些药物在降低血糖的同时具有严重的副作用，如氯磺丙脲常见肝损害，双胍类在降低血糖的同时易引起乳酸性酸中毒，死亡率较高〔5〕。需长期治疗的2型糖尿病患者，化学合成药物严重的副作用不利于提高患者生活质量及生存率。因此，寻找一种新的具有良好降糖效果的药物，更重要的是这种药物应无毒副作用或毒副作用极少。基于民间有蚕茧泡水辅助降糖的验方，本课题组的前期研究对丝胶(蚕茧水提物)的降糖作用进行了初步探讨，发现丝胶不仅具有良好的降糖效果，并且可调节糖尿病时血脂代谢紊乱，及通过抑制糖尿病时胰岛β细胞凋亡保护糖尿病时胰岛细胞损伤〔6,7〕。

HNF是调控肝脏基因特异性表达的一类转录因子，通过与靶基因调控区顺式作用元件的结合调节靶基因的表达〔8〕。HNF-4α在肝脏表达水平较高，参与调控糖脂代谢及胰岛素分泌，并与胰岛素抵抗有关〔9〕。本研究发现，糖尿病模型大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达均明显升高，与Oyadomari等〔10〕的研究结果相一致。Yoon等〔11〕的研究发现，PGC-1α作为糖异生途径的关键调节因子，在肝脏过度表达可激活糖异生关键酶组，但必须依靠与HNF-4α的直接接触才能发挥作用；另外，HNF-4α可调节肝脏内糖异生途径中限速酶之一的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因的特异性表达，同时是葡萄糖转运蛋白2、醛缩酶B、丙酮酸激酶基因表达所必需的〔12,13〕。因此推测，糖尿病模型大鼠肝脏HNF-4α的表达升高可引起肝糖输出增加，糖酵解速率可能也有所升高，但不能抵消肝糖输出的增加，从而进一步导致血糖的难以控制〔14〕。

另外，本研究还发现，丝胶可明显降低糖尿病模型大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达，表明丝胶可通过下调糖尿病大鼠肝脏HNF-4α的表达，保护糖尿病时的肝脏损伤。但是丝胶下调糖尿病大鼠肝脏HNF-4α表达的作用，是由丝胶促进胰岛素分泌引起的继发性改变，还是丝胶本身可直接下调HNF-4α的表达，从而调节糖酵解效率和PEPCK等糖代谢过程限速酶的基因表达，最终导致血糖降低的综合结果，或两方面双重调节作用的结果，还有待深入研究。

4参考文献

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〔2014-03-04修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)