红藻氨酸致痫大鼠海马Cav-1、EphrinA2蛋白的变化及肉桂醛的干预作用

红藻氨酸致痫大鼠海马Cav-1、EphrinA2蛋白的变化及肉桂醛的干预作用

金玉玲臧兆平1罗海龙2李欣李玲3董红梅

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探讨肉桂醛对红藻氨酸(KA)致痫大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的影响。方法60只雄性Wistar大鼠随机分成正常组、NaCl组、癫痫组、肉桂醛低剂量(25 mg/kg)组、肉桂醛中剂量(37.5 mg/kg)组及肉桂醛高剂量(50 mg/kg)组。癫痫组和肉桂醛治疗组均采用大鼠脑右侧海马CA3区一次性注射1 μg/μl KA 1μl诱发癫痫发作，NaCl对照组注射等量NaCl溶液，观察其行为学表现，Western印迹检测各组大鼠海马组织Cav-1和EphrinA2蛋白的表达。结果实验性癫痫大鼠模型制作成功，肉桂醛各剂量组和癫痫组实验动物全部达到点燃标准，肉桂醛治疗组大鼠癫痫发作潜伏期延长，发作时间明显缩短，发作级别降低。海马区Cav-1和EphrinA2蛋白的表达在正常组与NaCl组无差异(P>0.05)；与NaCl组比较，癫痫组大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白表达均明显增加(P<0.01)；肉桂醛各治疗组大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的表达低于癫痫组(P<0.05)，且与肉桂醛浓度有关。结论KA海马区注射可获得稳定的癫痫大鼠模型，肉桂醛通过降低大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的表达，起到抗癫痫作用。

关键词〔〕癫痫；肉桂醛；小窝蛋白-1；EphrinA2

中图分类号〔〕R742.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省教育厅项目(No.12521572)

1齐齐哈尔医学院附属第三医院

2牡丹江医学院附属红旗医院3吉林省东丰县医院

第一作者：金玉玲(1969-)，女，副主任医师，硕士生导师，主要从事脑损伤机制和防治的研究。

癫痫(EP)是一种最常见的世界性的神经系统难题，为多种病因引起的神经系统异常放电造成以突发性、暂时性脑功能失常为特征的脑功能障碍综合征。EP患者需要长期服用抗EP药物控制EP发作时间及频率，但仍有20%左右的患者经长期正规药物治疗后仍难以控制而形成难治性EP，且目前抗EP药物虽应用于临床，但只是控制症状，长期应用可导致认知功能障碍等副作用。因此，寻求一种特异性强、副作用小的抗EP药物具有十分重要的意义。肉桂醛具有抗菌、降低血糖和抗肿瘤等作用〔1，2〕，但在EP方面的研究甚少。

1材料和方法

1.1试剂兔抗小窝蛋白(Cav)-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗EphrinA2多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司；牛血清白蛋白和红藻氨酸(KA)购自美国sigma公司；碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组60只成年健康雄性Wistar大鼠，3～5月龄，体重200~250 g，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供(许可证号：医动字第09-2号)，分笼适应喂养>1 w。随机将其分为六组，每组10只：EP组(大鼠CA3区注射KA致癫)，肉桂醛低剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫，连续7 d腹腔予肉桂醛25 mg/kg)，肉桂醛中剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫，连续7 d腹腔予肉桂醛37.5 mg/kg)，肉桂醛高剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫，连续7 d腹腔予肉桂醛50 mg/kg)，正常组(大鼠CA3区不注射)，NaCl组(大鼠CA3区注射NaCl，连续7 d腹腔给等量NaCl溶液)。

1.2.2动物模型制备Wistar大鼠以10%水合氯醛0.3~0.4 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，按照Paxinos&Watson大鼠脑立体定向图谱，以前囟为靶点定位：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm；根据前囟标记点和Paxinos&Watson脑功能定位图谱钻孔，并参照大鼠的颅骨解剖图，穿刺海马CA3区，无菌且实验动物清醒条件下，用 1 μl微量注射器注入浓度为1.5 μg/μl的KA 1 μl(每次注射前以NaCl溶液新鲜配制)，注射药物时间每次持续10~15 min，0.1 μl/1 min，留针5 min。根据KA诱发大鼠的行为学改变判定EP大鼠模型的建立。NaCl组相同部位等时注入等量的NaCl溶液。

1.2.3大鼠行为学观察大鼠海马局部注射KA或NaCl后，观察行为学变化。EP大鼠发作行为学变化的分级标准：0级：正常行为状态，无发作反应；Ⅰ级：咀嚼、眨眼、立须等口周及面部肌肉抽搐，湿狗样颤动；Ⅱ级：以点头运动为主要表现的颈部肌肉抽搐；Ⅲ级：前肢阵挛、抽搐；Ⅳ级：双侧前肢伸直，伴有身体的立起；Ⅴ级：跌倒和全身惊厥。Ⅲ级以下为复杂部分发作，Ⅳ级和Ⅴ级为全身强直阵挛发作〔3〕。注药后立即进行行为学观察，海马局部注射KA的大鼠，在1 h内出现Ⅰ~Ⅴ级行为变化的归为EP模型。

1.2.4Western印迹法进行蛋白测定海马组织样品蛋白裂解液与5倍上样缓冲液混合，100℃变性5 min，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，40 V，电转移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜。PVDF封闭过夜，Cav-1蛋白和EphrinA2蛋白兔源多克隆抗体37℃，2 h，辣根过氧化物酶标记二抗37℃，1 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗。增强化学发光法(ECL)显色试剂显色，对照Marker记录实验结果。将结果进行拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.3统计学方法应用SPSS11.5软件行t检验。

2结果

2.1行为学观察注射KA后，麻醉未醒的30 min内，大鼠安静，偶见眨眼、动须、面肌抽搐；苏醒后，大鼠咀嚼、眨眼、动须、动耳(Ⅰ级)及点头、翘尾(Ⅱ级)；继之出现对侧前肢阵挛(Ⅲ级)，双侧前肢阵挛(Ⅳ级)，四肢抽搐、跌倒(Ⅴ级)；在30~60 min出现EP持续状态(SE)，每次发作时间持续数分钟至数小时，反复多次。EP组及肉桂醛各用药组大鼠每天注射KA后均有不同程度的EP发作表现，EP组实验动物在注射KA后1~7 min内即开始发作，每次发作持续时间不等，在肉桂醛注射初期与EP组发作相仿，潜伏期稍长，用药后期，潜伏期延长，发作时间明显缩短，发作级别降低且少有大发作。正常组无任何异常行为表现。肉桂醛各用药组和EP组均出现Ⅲ级以上多次EP发作，比较其潜伏期和到达重型发作时间有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠EP发作潜伏期、到达重型发作

与EP组比较：1)P<0.01：2)P<0.05

2.2EP大鼠海马 Cav-1和EphrinA2蛋白的表达NaCl组和正常组Cav-1(0.51±0.05 vs 0.53±0.05)和EphrinA2蛋白(0.60±0.03 vs 0.60±0.05)的表达无差异(P>0.05)；EP组大鼠海马Cav-1蛋白(0.86±0.03)和EphrinA2蛋白(0.82±0.04)的表达显著高于NaCl组(P<0.01)；与EP组比较，肉桂醛低、中、高剂量组Cav-1蛋白(0.78±0.04、0.71±0.03、0.65±0.02)和EphrinA2蛋白(0.73±0.03、0.67±0.02、0.61±0.04)的表达明显降低(P<0.05)。见图1。

1：正常组；2：NaCl组；3：EP组；4：肉桂醛低剂量组；5：肉桂醛中剂量组；6：肉桂醛高剂量组 图1　大鼠海马组织 Cav-1和EphrinA2蛋白的表达

3讨论

颞叶EP(TLE)是难治性EP的主要类型，是一种主要起源于内侧颞叶的部分发作性EP。KA，即海人酸，首先由日本人从海藻中提取出来，其结构类似于谷氨酸，能产生很强的神经兴奋作用。它可以与突触后膜的海人酸受体(海马CA3区的KA受体最多)结合，产生兴奋性突触后电流，导致动物EP发作，即为海人酸EP模型。KA模型是常用的EP持续状态模型及自发发作模型〔4〕。本实验直接将KA注射到雄性Wistar大鼠海马CA3区，由于海马病变引起的继发性EP的行为症状、特异性的海马损伤病理改变及复发的自发性抽搐，类似人类的颞叶EP，所以取CA3区为注射药物的作用点更直接、更方便，也更容易出现颞叶EP的病理学改变。

EP脑损伤是EP发作的结果，也是EP频发和难治的原因。肉桂醛是中药肉桂油的主要成分，肉桂作为一种传统中药，具有镇静、镇痛、解热、抗惊厥等多种药理作用〔5〕。本实验KA通过行为学观察发现，应用肉桂醛后，EP大鼠EP发作潜伏期延长，发作时间明显缩短，发作级别降低且少有大发作，提示肉桂醛可减轻EP发作。

颞叶EP的病理基础是苔藓纤维出芽、异常兴奋环路的形成〔6〕，引起神经元异常放电，增加EP发作的敏感性并促进EP的形成〔7〕。

Cav-1是细胞膜上小窝结构的基本结构蛋白，在小窝结构的维持、多种信号通路的调节中起重要作用。Cav-1不仅参与脂质代谢、调节细胞凋亡、介导内吞作用，还在肿瘤发病过程具有重要作用〔8，9〕。Caveolin蛋白在神经系统中分布广泛，脊髓、底丘脑核、黑质、尾状核和海马等部位的神经细胞和神经胶质细胞中均有Cav-1的表达〔10〕。Cav-1与脑功能的生理和病理变化有关，影响神经发育、突触可塑性等过程〔11〕，且参与阿尔茨海默病(AD)、脑缺血性疾病和出血性脑中风发病过程〔12，13〕，这些证据也暗示Cav-1可能与EP有关。 轴突导向因子是近年有关EP发病研究中的一个热点，正常情况下，在体内低水平表达，主要维持原有轴突和突触稳定并抑制轴突芽生的作用。Ephrins家族是重要的轴突导向因子，而EphrinA2是Ephrins家族成员之一，广泛表达在脑组织尤其是海马中，与EP发作密切相关〔14〕。

相关研究〔15〕发现EphrinA2在颞叶中致痫灶周围的表达水平明显高于正常对照组，与本实验结果一致。Cav-1与EphrinA2关系密切，有研究〔16〕表明缺乏Cav-1导致微血管密度显著降低，而这种结果与EphrinA2受体的失活有关，提示Cav-1-EphrinA2轴促进血管瘤内皮细胞迁移。提示肉桂醛可通过降低Cav-1的表达导致EphrinA2受体失活，抑制轴突导向因子EphrinA2的表达，稳定突触，抑制突触可塑性的激发，从而抑制EP发作。

综上所述，肉桂醛可通过降低EP大鼠海马组织Cav-1蛋白和轴突导向因子EphrinA2蛋白的表达，导致EP大鼠潜伏期延长，发作时间明显缩短，从而降低KA诱导EP大鼠痫性发作，为初步了解肉桂醛抗EP的作用提供一定理论基础。

4参考文献

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〔2014-03-17修回〕

(编辑袁左鸣)