阆中市副猪嗜血杆菌病的分子流行病学调查及主要血清型确定

李建华，沈峻宇 ，杨 嵩，陈定超

（1.四川省阆中市畜牧局，四川 阆中 637400；2.四川省南充市顺庆区畜牧局，四川 南充 637000；3.四川省畜牧总站，四川 成都 610041）

副猪嗜血杆菌（HPS）起初被称为猪嗜血杆菌或猪流感嗜血杆菌，是猪上呼吸道的一种常在菌[1]。该菌常与其他呼吸道病原混合或继发感染[2-4]，主要的攻击对象是仔猪和青年猪。本试验对阆中市16个规模化猪场进行了HPS流行病学调查，为当地有效防控该病提供依据。

1 试验材料

1.1 病料来源及实验动物 病料来源于阆中市的16个规模化养猪场，采集自疑似患副猪嗜血杆菌病的猪的肺脏、鼻拭子、气管黏液、淋巴结、肾脏、脾脏、关节液和心包渗出液等。

副猪嗜血杆菌的阳性病料由四川农业大学动物医学院动物检疫实验室保存并提供。试验中用于制备各个分型血清的健康家兔（体重3～4kg/只），购自四川农业大学农场。

1.2 所需分子生物学试剂 蛋白酶K、SDS、Ttis饱和酚，2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker DL2000、pMD19-T Vector，琼脂糖，NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），Column DNABACK柱式DNABACK，细菌基因组DNA提取试剂盒，其他试剂如无水乙醇、氯仿等均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50FB，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9146A，高速冷冻离心机Sigma 3-18K，恒温水浴锅，微量加样器，PCR仪Mycycler，核酸电泳系统DYY-2C，稳压稳流型电泳仪DYY-III-8B，全自动凝胶成像分析系统，涡旋混合振荡器，水浴锅。

1.4 培养基 LB培养液、LA培养基、TSA培养基、TSB培养液和氨苄平板，其制备均按照说明书进行。

1.5 引物的设计与合成 从Genbank上下载已经公布的HPS 16S rRNA核苷酸序列，根据HPS 16S rRNA序列设计引物，引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

表1 HPS引物设计

按使用说明将引物稀释为10pmol/μL，放-20℃冰箱中备用。

2 方法

2.1 细菌分离培养 用无菌接种环蘸取肺脏组织、气管黏液、心包渗出液和关节液接种在含0.05%NAD的TSA 培养基上，置37℃温箱中培养24～48h，观察细菌菌落，再进行细菌纯培养。

2.2 HPS的PCR鉴定 PCR鉴定按Oliveira等建立的HPS PCR鉴定方法进行HPS 16S rRNA基因的PCR扩增，扩增片段大小为821 bp。细菌基因组DNA的抽提按细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。采用PCR技术对提取的DNA进行扩增，同时做阴性对照和阳性对照。反应体系（20μL）为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，双蒸水 5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板3μL。

取8μL PCR产物加入1%琼脂糖凝胶板加样孔中，同时取8μL DNA Marker DL2000作为参照物，在120V电压下电泳20min，结束后将1%琼脂糖凝胶放于紫外凝胶成像仪中观察并保存图像。

2.3 HPS 16S rRNA克隆与序列分析 若2.3中出现正确的目的条带（821bp），则进行基因克隆与序列分析。

2.3.1 凝胶块中DNA的胶回收、纯化 胶回收按照下列步骤进行：在胶回收离心管中按重量比1∶3～1∶5加入通用溶胶液（即：100mg的琼脂糖凝胶需要加入300～500μL通用溶胶液），放50℃水浴锅中使胶完全溶化；将离心管中的溶液转到离心吸附柱中，套上收集管，静置3min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，加入0.7～0.8mL的通用洗柱液，室温静置2min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，再以12000r/min离心30s，以除去离心柱中的残留液体；将离心柱放于一支新的干净的离心管中，加入30～100 μL 50～65℃的 DNA 洗脱液，静置 3 min，12 000r/min离心1min，离心管里所得的溶液即为胶回收产物。放于-20℃冰箱中备用。

2.3.2 感受态细胞的制备 将大肠杆菌DH5α贮存液在无菌LA平板上划线，37℃培养箱培养过夜，挑取单个菌落接种到一只装有5mL LB培养液的灭菌试管中，37℃ 200r/min振荡培养过夜，按照1%（V/V）比例接入新鲜LB培养液，取2mL接种于100mL LB培养液中，37℃ 200r/min振荡培养2～2.5h，测得OD值为0.5左右（此时细菌处于对数生长期）。将菌液加入到无菌EP管中，冰上放置10min后，4℃ 5000r/min离心10min，弃上清，将菌体悬浮于10mL的无菌、预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液中，4℃ 3000r/min离心10min，弃上清，再将菌体悬浮于2mL的无菌、预冷的已经加入甘油的0.1mol/L CaCl2溶液中（甘油按照15%比例加入），分装到无菌1.5mL EP管中，放4℃冰箱过夜后，置于-70℃冰箱中保存备用。

2.3.3 连接 将胶回收产物与pMD19-T载体连接，反应体系（10μL）为：Solution I 5μL，pMD19-T 1μL，胶回收产物4μL。16℃连接过夜。

2.3.4 转化 在无菌条件下，将新鲜制备或者在-70℃保存备用的DH5α感受态细胞在冰上溶解后轻轻混匀。取10μL连接产物，无菌加入已经均匀悬浮的100μL DH5α感受态细胞中，温和摇匀，冰浴30min，42℃水浴，热激90s。冰浴3～5min（使感受态细胞的细胞膜通透性增加，让质粒充分进入细菌内），加入37℃的900μL LB培养液（无Amp），在37℃水浴锅内250r/min温和振荡1h，使细菌恢复耐药性。室温下，3000r/min离心5min，弃去700μL上清液，用剩余的培养液将细菌沉淀悬浮，均匀涂布于氨苄平板上，在37℃培养箱中正向放置30min吸取掉多余液体后，倒置，培养10～16h。无菌挑取单个菌落接种于3～4mL含Amp溶液的LB培养液中，37℃ 250r/min振荡培养 6～8h。然后按 7∶3（菌液∶甘油）分装至无菌EP管中，其中一管用于测序，其余放-70℃冰箱内保存。

2.3.5 序列比较 从NCBI上下载已经公布的HPS 16S rRNA 序列（登录号：AB004039.1、AB004037.1、AB004036.1、AB004035.1、AB004034.1），将这些基因的相应区域与测序结果用DNAMAN软件进行比对，查看其同源性。

2.4 血清型的确定 本试验用兰州兽医研究所馈赠的血清型1～15标准株来制备副猪嗜血杆菌分型血清，并根据玻板凝集试验[5]确定HPS的血清型。

2.4.1 分型血清的制备 分别用血清型1～15标准株划线接种于TSA平板上，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，接种于含4～5mL TSB培养液的试管中，37℃ 250r/min振荡培养6～8h后涂布于TSA平板，放37℃培养箱中培养24～48h，然后用含0.2%福尔马林的PBS（pH=7.2）冲洗下来，37℃过夜灭活，4℃4000r/min离心10 min，洗涤两次，调整菌液浓度，使得OD600约等于1。然后均分成两份，其中一份与等量的弗氏完全佐剂制成弗氏完全佐剂疫苗，另一份与等量弗式不完全佐剂制成弗式不完全佐剂疫苗。

每株标准株都按以下程序免疫健康家兔2只：用1.5mL弗氏完全佐剂疫苗于背部多点注射（第一次免疫），14d后再用1.5mL弗氏完全佐剂疫苗于背部多点注射（第二次免疫），11d后用3mL弗式不完全佐剂疫苗于背部多点注射（第三次免疫）；11d后用0.5mL病菌新鲜培养物（OD600值≈1）对每只家兔进行耳静脉注射攻毒，7～14d后采血，无菌分离血清，做玻板凝集试验测血清抗体，若出现明显肉眼可见的凝集物就放血收集血清，若没有凝集物出现，就继续用0.5mL病菌新鲜培养物攻毒，7～14 d后再采血检测，仍然不合格就重新免疫。以健康家兔的血清作阴性对照。所有血清于-20℃保存备用。

2.4.2 血清学分型 用PBS冲洗下TSA平板上生长的各分离株菌苔作为待检菌液，将0.3mL待检菌液与0.3mL分型血清混匀，同时用健康家兔血清作阴性对照。数分钟后，若混合液仍均一浑浊，则为阴性反应；若出现肉眼可见的凝集物，则为阳性反应，表示分离株与产生凝集物的标准株的血清型相同。

3 结果

3.1 流行病学调查结果 196份疑似HPS病料主要采集自21～60日龄的断奶仔猪和保育猪，疑似病例全年都有发生，但在4～9月份相对集中。在所调查的196份病料中，共分离出了11株HPS，分离率只有5.61%，其中有9株是4～9月采集病料时分离出的，表明该病在4～9月发生明显；分离出的HPS病料主要来自断奶仔猪和保育猪，分离部位主要在肺脏和支气管，肺脏、支气管和关节液的分离率分别为54.5%（6/11）、36.4%（4/11）和 9.1%（1/11），说明肺脏和气管是HPS存在的主要器官。

3.2 细菌分离培养结果 培养基上的细菌菌落光滑湿润，呈针尖大小、无色透明的露珠状，约0.5 mm左右。取纯培养36h的菌落涂片、革兰氏染色、镜检，结果为革兰氏阴性细小杆菌。

3.3 HPS的PCR鉴定 使用HPS 16S rRNA基因扩增引物对分离的细菌进行16S rRNA基因扩增，结果从分离的细菌基因组DNA中均扩增出821 bp的目的片段。

3.4 HPS 16S rRNA序列分析 结果见表2。根据HPS 16S rRNA序列设计引物，经PCR技术扩增后，电泳发现产物条带大小为821bp，与预期相符。将分离到的11株HPS的PCR产物送到华大基因公司测序，将测序结果与标准株进行比对，结果发现其同源性为96.2%～99.76%，说明检测出的确实是副猪嗜血杆菌阳性病料，而且HPS 16S rRNA序列保守性较高，不会因为地域不同发生很大的变异。

表2 同源性比对结果

3.5 HPS分离株的血清型鉴定结果 将分离到的11株HPS的菌液0.3mL与各分型血清0.3mL混合均匀，通过玻板凝集试验进行血清型分型，同时用健康家兔血清作阴性对照，结果显示有8株能够准确分型，有2株出现交叉反应，难以判断，有1株不能与这15种分型血清发生阳性反应，不能分型。在能分型的菌株当中，血清型依次是5型4株、4型3株、12型1株。各分离株的血清型及其分布地区见表3。

表3 各分离株的血清型及其分布地区

4 讨论与小结

本试验从196份疑似病料中检出了11份阳性病料，阳性检出率较低（为5.61%），可能是临诊时把副猪嗜血杆菌病与支原体肺炎、传染性胸膜肺炎、猪链球菌病等病混淆，致使所采集的病料不完全是副猪嗜血杆菌病阳性病料。从采集时间推断该病在春、冬季的发病率低于夏、秋季。该试验还成功地克隆了这11株HPS的16S rRNA，将这些序列与NCBI上已公布的HPS序列进行同源性分析，发现其同源性在96.2%～99.76%之间，具有较高的保守性。

目前副猪嗜血杆菌的分型方法主要有血清学分型、基因分型、多态性图谱分型。副猪嗜血杆菌血清型众多，制备血清型1～15的各个分型血清是一件很困难且耗时耗力的工作。本试验发现，不同血清型的菌株刺激动物机体产生抗体的水平有很大差异，其中血清型 15、14、13、12、11、9、6、5、3 的菌株在第一次攻毒后就可与相应的热稳定性抗原发生明显的阳性反应，而血清型10、8的菌株需要连续攻毒3次才能获得比较满意的结果。

有研究报道，采用琼脂扩散方法对HPS进行血清型分型时，抗原制备的方法对HPS血清学分型的效果有较大影响[6-7]。本试验用玻板凝集试验对分离株进行血清分型，避免了琼脂扩散方法中抗原制备不当而对试验结果造成影响。

近年来，副猪嗜血杆菌的耐药性越来越明显，国家对抗生素在动物饲料中的应用限制得比较严格，所以疫苗会逐步取代抗生素，成为预防、控制本病的主要措施[8]。但在实际生产中，有的疫苗免疫效果并不明显，这可能与血清型有关；也可能是因为临床上用的大都是灭活苗，而灭活苗的交叉保护性低、免疫原性差，不能刺激机体产生免疫应答反应；还有可能与猪群的健康状况有关。

不同血清型的副猪嗜血杆菌的毒力和致病力存在差异，毒力和免疫保护作用呈正相关。母安雄等[9]研究报道：血清型 5、1、10、13、12、14 为高毒力菌株，血清型 4、2、15 为中等毒力菌株，血清型 6、3、7、8、11为无毒力菌株。本次在阆中市分离出的HPS的血清型主要是5型、4型和12型，这些血清型的菌株基本上都是高毒力菌株。在制备针对阆中市HPS的有效疫苗时，可以将高毒力的血清型5、4、12菌株通过诱导发生突变，再选出毒力减弱的菌株制备成弱毒疫苗，这样应该有明显的免疫效果且对仔猪的安全性较高。

[1]贺英，赵萍，储岳峰，等.福建省部分地区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查[J].贵州农业科学，2010，38（2）:130-131.

[2]Oliveira S，Pijoan C.Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints[J].Canadian Journal of Veterinary Research，2004，68（1）:71.

[3]Biberstein E L，White D C.A proposal for the establishmentoftwo new Haemophilusspecies[J].Journal of Medical Microbiology，1969，2（1）:75-78.

[4]王祝荣，卢寄军，张进.副猪嗜血杆菌16S rRNA基因的克隆及序列分析[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）:92-94.

[5]赵冉，陈琼，蔡振鸿.副猪嗜血杆菌病的研究进展[J].福建畜牧兽医，2008，30（3）:20-23.

[6]陆国林，何海健.副猪嗜血杆菌病的研究进展[J].中国畜牧兽医，2009（12）:162-165.

[7]涂玉蓉，李美娣，卓曲，等.副猪嗜血杆菌分型方法的研究进展[J].福建畜牧兽医，2012，34（5）:44-46.

[8]苏丹萍，王文豪，章胜，等.副猪嗜血杆菌弱毒疫苗的研制[J].中国畜牧兽医，2012，39（11）:169-173.

[9]母安雄，应小飞，陶益，等.副猪嗜血杆菌的研究进展[J].中国畜牧兽医，2006，32（11）:48-50.