肢体缺血预处理对脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响

降低循环AngⅡ,通过中枢层面减少交感神经活性的同时也不排除能够降低压力反射重调定从而进一步易化BRS。③抗动脉粥样硬化作用。大量研究证实,四逆汤能明显降低载脂蛋白B,增加载脂蛋白A(apoA)含量,从而减缓动脉粥样硬化程度,使斑块面积缩小,减轻内膜增厚水平,且其抗动脉粥样硬化作用与四逆汤剂量呈一定的量效依赖关系[10,11]。BRS减弱与其感受器敏感性降低有密切相关性,BRS的感受器位于颈总动脉末端和颈内动脉起始处的膨大部分,高血压发生颈动脉粥样硬化的几率很高,因此四逆汤也有可能是通过减低颈动脉粥样硬化,增加感受器敏感性,从而达到易化BRS的作用。

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(本文编辑郭怀印)

肢体缺血预处理对脑缺血再灌注大鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响

李 娜1,李光来2,张晓敏2,薛国芳2,李 满2,冯 鹏2

摘要:目的 研究肢体缺血预处理(LIP)对脑缺血再灌注不同时间点大鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响。方法 72只健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组24只、缺血再灌注组(MCAO组)24只、肢体缺血预处理组(LIP组)24只,MCAO组和LIP组根据再灌注时间的不同,分为3 d、7 d、14 d、21 d组,每组6只。于各相应时间点观察各组大鼠并进行神经功能评分,免疫组织化学方法观察神经干细胞的增殖情况。结果 LIP组各时间点大鼠神经功能评分较MCAO组减低(P<0.05);MCAO组各时间点5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性细胞数均较假手术组明显增多(P <0.05或P <0.01),LIP组各时间点BrdU阳性细胞数均显著多于MCAO组(P<0.05),且LIP组BrdU的高峰值(14 d)较MCAO组(7 d)延长(P<0.05)。结论 反复短暂的无创性肢体缺血预处理可以改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损症状,并且可激活脑缺血再灌注后内源性神经干细胞的增殖,在脑缺血再灌注损伤中具有一定的保护作用。

关键词:肢体缺血预处理;脑缺血再灌注;神经干细胞

收稿日期:(2015 01 06) (2015 01 23)

中图分类号:R743 R255.2

文献标识码:A

doi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.12.009

文章编号:1672-1349(2015)12-1384-03

通讯作者:李光来,E mail:smuneu@163.com注损伤的问题,而由其引起的一系列复杂的继发改变,导致缺血组织损伤恶化,临床应用有限。

作者单位:1.山西医科大学(太原030001);2.山西医科大学第二临床医学院

脑卒中是临床上常见的急性脑血管病,其中75%为缺血性脑卒中。目前,以溶栓和脑保护作为缺血性脑卒中的主要治疗策略。然而超早期溶栓治疗的时间窗较短,禁忌证多,并且恢复局部血供后,会带来再灌

脑缺血再灌注损伤是一个比较复杂的病理生理过程,而神经元的损伤在此过程中是不可避免的。有研究发现,哺乳动物中枢神经系统有产生新神经元和修复受损区的能力,而这种能力与脑内的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是分不开的[1]。NSCs在体内一般以静息状态存在,当受到一定的刺激后被激活。有研究发现,脑的缺血损害可以激活脑内原位神经干

细胞的增殖[2 4],但由此激活的神经干细胞数量不足,且其中分化为神经元的只有小部分[5,6],所以增殖的NSCs对脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损的修复并不完全。近年来的研究发现肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP)可以激活脑梗死后神经干细胞的增殖[7],在此研究中,采用了分离股动脉之后进行反复夹闭和松开作为肢体缺血预处理的方法,此种方法有创且操作复杂。如果采用一种无创、操作简便且安全性较高的预处理方法,将更易于被病人接受,在临床中也能得到更好的应用。为了证明这种方法是否可以激活脑缺血再灌注后内源性神经干细胞的增殖,本实验采用改良的动物无创血压测试仪自制套管,观察LIP对大鼠脑缺血再灌注后海马内源性神经干细胞增殖的影响。

1　材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠72只(山西医科大学实验动物中心提供),鼠龄3个月~4个月,体重200 g~220 g。

1.1.2 试剂与仪器 BrdU粉剂(美国Sigma公司),小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体、生物素化羊抗小鼠、SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法 72只SD大鼠,随机分为假手术组、缺血再灌注组(MCAO组)、肢体缺血预处理组(LIP 组)。MCAO组:缺血2 h后再灌注,根据再灌注的时间不同又分为4个亚组(3 d、7 d、14 d、21 d),每组6只。LIP组:于LIP模型后立刻制备MCAO模型,根据再灌注的时间又分为4个亚组(3 d、7 d、14 d、21 d),每组6只。

1.2.2 MCAO模型的制备 参照改良Longa[8]法, 10%水合氯醛麻醉大鼠,分离并结扎右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA),分离并用动脉夹夹闭颈内动脉(ICA),在CCA距离分岔口大约0.5 cm处剪一小口,将直径0.235 mm的鱼线插入,在剪口上方2 mm处系一活结,松开动脉夹,将鱼线沿CCA插入ICA内,以分岔口处开始测量距离,插入1.8 cm±0.5 cm后将之前的活结打死以固定鱼线,缝合。2 h后轻轻将线栓拉出1 cm左右,形成再灌注。假手术组的鱼线只插入1.0 cm,其余步骤同实验组。

1.2.3 LIP模型的制备 将无创性血压测试仪的自制套管套于大鼠左后肢根部后,加压阻断股动脉10 min,其阻断标志为脉搏消失,皮肤发绀,触摸远端肢体体温下降;10 min后减压,以恢复血流达到再灌注的目的,以脉搏出现,皮肤潮红,远端肢体体温回升为再灌注标志,做3个循环。

1.2.4 神经行为评分 参考Longa等的5级4分法标准:0分,无神经功能缺损症状;1分,轻度局灶性神经功能缺损,即提尾不能伸展左侧前爪;2分,中度局灶性神经功能缺损,即行走向左侧转圈;3分,重度局灶性神经功能缺损,即行走困难,并向左侧倾倒;4分,不能自发行走,意识水平下降。将评分为1分~3分的大鼠作为研究对象。

1.2.5 BrdU标记方法 各组大鼠根据其再灌注相应时间点,以50 mg/kg腹腔注射,每4 h给药1次,共3 次,于第3次给药后24 h取脑。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件分析处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。两组以上总体均数的比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1 各组大鼠的神经功能评分比较(见表1)于各相应时间点观察各组大鼠并进行神经功能评分,LIP组与MCAO组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示LIP减轻了大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经缺损症状。

表1　各组大鼠不同时间点神经功能评分的比较(x±s)　　分

2.2 各组大鼠缺血再灌注不同时间点BrdU阳性细胞数 各组大鼠于各相应时间点处死,取缺血侧海马组织观察BrdU阳性细胞数,BrdU阳性细胞数呈棕褐色颗粒,胞核较大、深染,呈圆形。MCAO组各时间点BrdU阳性细胞数均较假手术组明显增多,LIP组各时间点BrdU阳性细胞数均显著多于MCAO组;且MCAO组中BrdU阳性细胞于第7天达高峰,而LIP组的BrdU阳性细胞于缺血再灌注后第14天达高峰。

详见表2。

表2　各组大鼠缺血侧海马BrdU阳性细胞数的比较(x±s)　　个/mm 2

3　讨 论

近年来的研究发现,LIP可能通过提高脑组织抗氧化酶活性[9]和诱导血管再生[10]等对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用,且LIP能够激活脑梗死后神经干细胞的增殖[8]。神经干细胞有自我更新和多向分化的潜能,来自早期胚胎阶段的神经上皮细胞。大量的研究发现,外源性干细胞的移植[11]和不同预处理方法[12 14]对脑缺血再灌注损伤后神经干细胞的增殖有促进作用,对神经功能起到一定的保护作用[15]。但由于这些预处理方法有一定的创伤、操作较复杂,且不易被病人接受,而外源性干细胞的移植又存在免疫排斥反应和需长期使用免疫抑制剂等问题,使这些措施在临床治疗工作中受到一定的局限性。因此,本实验采用无创血压测试仪自制套管做预处理方法,观察其对随后脑缺血再灌注损伤后海马区BrdU阳性细胞数的表达,研究无创性肢体缺血预处理对内源性神经干细胞增殖的影响,为临床实际治疗工作中提供了一种无创且操作简单,病人更易接受的预处理方法。

Brdu由于其结构与胸腺嘧啶核苷酸类似,在有丝分裂的S期作为底物掺入新合成的DNA链中,因此成为细胞增殖能力的标记。本研究结果显示:MCAO组的BrdU阳性细胞数较假手术组明显增多,LIP组的BrdU阳性细胞数较MCAO组增多,且MCAO组的BrdU阳性细胞于缺血再灌注后第7天达高峰,而LIP组的BrdU阳性细胞于第14天达高峰值。说明反复、短暂的肢体缺血预处理激活了随后即刻发生的脑缺血再灌注损伤大鼠海马内源性神经干细胞的增殖,且延长了增殖的高峰期。而LIP组各时间点大鼠神经功能评分较MCAO组减低,说明LIP激活内源性神经干细胞的增殖,增殖的干细胞可能起到神经功能的保护作用,从而减轻了脑缺血再灌注损伤带来的神经功能缺损症状。

综上所述,无创性肢体缺血预处理通过激活内源性神经干细胞的增殖,在随后即刻发生的脑缺血再灌注损伤中起到一定的保护作用,从而为缺血性脑卒中的实际治疗工作中提供了一种无创且操作简单,易于被病人接受的预处理方法。

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(本文编辑郭怀印)

·综述与进展·