四物汤干预减轻乙醇对小鼠肝脏的损伤作用

研究报告

四物汤干预减轻乙醇对小鼠肝脏的损伤作用

白云峰1，李晓娟2，李永纲1，王立福1，李蓓2，王睿林1，李瑞生2

(1. 解放军第302医院中西医结合肝病诊疗与研究中心，北京100039；

2. 解放军第302医院实验技术研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的通过四物汤对小鼠酒精性肝损伤的干预效果的研究，阐明其对乙醇损伤肝脏的影响，为四物汤临床防治酒精性肝病提供实验数据。方法选择60只C57小鼠，随机分为对照组、模型组和四物汤低、中、高剂量(0.91、1.82、3.64 g/kg/d)组，每组12只，用50%乙醇灌胃建立酒精性脂肪肝模型，同时用四物汤进行干预。实验6周后，对各组小鼠的体质量、肝指数、血清生化指标和肝脏病理学改变进行综合对比分析。结果四物汤各剂量组小鼠与模型组相比其体重增长量均显著增加(P<0.05)，肝指数明显降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量(P<0.05)均显著降低。四物汤从低到高剂量组的肝脏外观从粗糙逐渐变光滑，颜色逐渐加深。病理结果也显示肝脏脂肪变随着剂量从低到高呈递减的程度，而高剂量组小鼠的脂肪变改善效果最显著。结论四物汤对小鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用。

【关键词】四物汤；乙醇； 肝脏损伤

[基金项目]解放军第302医院院长创新基金：YNKT2013026。

[作者简介]白云峰(1970-)，男，博士，E-mail： yunfengbai3@yahoo.com.cn；李晓娟(1980-)，女，硕士，E-mail： sxlily55@163.com。并列第一作者。

[通讯作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究员，从事人类疾病动物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；王睿林(1979-)，男，博士，主治医师，从事中西医结合治疗研究，E-mail： wrl7905@163.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.003

Protective effect of Siwu decoction on alcoholic hepatic injury in mice

BAI Yun-feng1，LI Xiao-juan2，LI Yong-gang1，WANG Li-fu1，LI Bei2，WANG Rui-lin1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center of Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo provide experimental data for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease in mice by a Chinese medicine, Siwu decoction, and study the intervention effect of Siwu decoction on alcoholic liver injury. MethodsSixty C57 mice were selected and randomly divided into the control group，model group and Siwu decoction low, medium and high dose (0.91, 1.82, 3.64 g/kg/d) groups, 12 mice in each group. The mouse models of alcoholic fatty liver were generated with gastric gavage of 50% ethanol, and Siwu decoction intervention was applied to these mouse models. Six weeks later，the mice body weight，liver index，serum biochemical indexes and liver pathological changes were determined and analyzed. ResultsCompared with the model group, Body weight gains of mice in all dose Siwu Decoction groups were significantly increased (P<0.05)，and liver indexes significantly decreased (P<0.05). The serum levels of ALT, AST and TG content significantly decreased(P< 0.05)．The liver gross appearance was gradually changed from rough to smooth and the color gradually deepened in the mice of Siwu decoction groups, increasingly from low to high dose group．Pathological examination showed a decrease of hepatic steatosis in the mice treated with Siwu decoction from low dose to high dose, and mice in the high dose group showed the best improvement of hepatic steatosis. Conclusion The Chinese medicine Siwu decoction has a protective effect on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Siwu decoction; Ethanol; Liver damage

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病，由于嗜酒已成为当今世界日益严重的公共卫生问题，因此酒精性肝病的研究也成为全球的研究热点[1]。乙醇进入体内会经过多种途径对肝脏造成损伤[2]，其中由乙醇引起氧化应激所产生的自由基可使线粒体膜通透性增加[3]，引起细胞能量代谢障碍而导致肝细胞损伤。而中药四物汤由白芍、当归、川芎和地黄组成，这四种中药均归经入肝，具有补血养肝，行瘀破滞之功[4]，近年来还报道四物汤具有增强血清超氧化物歧化酶活力，促进自由基消除的作用[5]。因此为了探讨四物汤是否对小鼠酒精性肝损伤过程具有干预作用，本实验选取近交系C57小鼠[6]，通过观察四物汤对急性酒精性肝损伤试验动物体质量、肝指数和肝细胞脂肪变性等的影响，分析其对急性酒精性肝损伤的防护作用及作用机理，以期为探寻ALD临床治疗药物奠定实验数据。

1材料和方法

1.1实验动物

选择SPF级C57雄性小鼠60只，单鼠体质量为20 g～22 g，购自军事医学科学院实验动物中心，生产许可证【SCXK(军)2012-0004】，实验在本实验室SPF级中进行，使用许可证【SYXK(军)2012-0010】。

1.2试剂及饲料

四物汤颗粒由302医院药剂室制备(3 g/袋)；乙醇(分析纯，纯度>99.7%)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130315)；生理盐水(解放军第302医院制剂室提供，批号：130527405，石家庄四药有限公司)。

1.3动物分组及实验方法

健康雄性C57小鼠60只，适应性喂养5 d后，随机分为5个组，分别为正常对照组、模型组、四物汤颗粒高剂量组(3.64 g/kg)、中剂量组(1.82 g/kg)、低剂量组(0.91 g/kg)，每组各12只。四物汤的剂量根据人临床剂量换算，换算公式：小鼠剂量(g/kg)=9.1 × 人临床剂量(0.1 g/kg)。此剂量作为低剂量，中剂量与高剂量分别为低剂量的2倍和4倍。每日正常组和模型组灌胃生理盐水，实验组灌胃不同剂量的四物汤，灌完间隔30 min后[7]，正常组继续用生理盐水灌胃，其余各组小鼠每日给予浓度50%乙醇灌胃，灌胃量为12 mL/(kg体重)[8]，持续6周。小鼠每周称重1次，按体重调整四物汤、乙醇灌胃量。实验期间小鼠均可自由进食和饮水。

1.4观察指标及检测方法

实验过程中每天观察各组小鼠精神状态，于实验结束前1 d禁食12 h，次日称重后经小鼠眶后静脉丛采血，离心取血清，检测各组小鼠血清生化指标：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)。取血后迅速取各组小鼠肝脏组织，称取肝脏重量，按公式计算：肝指数=肝质量(g)/体质量(g) × 100%；然后采集所有小鼠相同部位的肝组织用甲醛固定进行HE染色，在光学显微镜下观察分析各组小鼠肝脏的组织病理学结果。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，各组间采用方差分析进行比较，以P<0.05显示差异是否有显著性。

2结果

2.1各组小鼠体重增长量及生化指标的分析

通过对各组小鼠体重增长量、肝指数和生化指标的对比分析显示：与对照组比较，模型组小鼠的体重增长量显著降低(P<0.05)，肝指数显著增加(P<0.05)；与模型组比较，四物汤各剂量组小鼠的体重增长量均显著增加(P<0.05)，肝指数明显降低(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST和TG显著增高(P<0.05)；而与模型组比较，四物汤各剂量组血清ALT、AST和TG含量明显降低(P<0.05)，其中四物汤对AST和TG含量的影响呈现出剂量依赖性(表1)。

表1　各组小鼠体质量、肝指数和生化指标分析

注：与对照组比较 *P<0.05，与模型组比较△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各组小鼠肝脏外观的分析

肝脏外观标本显示：对照组小鼠肝脏被膜光滑，呈红褐色，质地柔软；模型组小鼠肝脏边缘呈圆钝状，色泽呈淡红色，质地较粗糙。四物汤各剂量组肝脏外观均较模型组肝脏颜色呈暗红色，而且从低剂量组至高剂量组肝脏颜色逐渐加深，肝脏外观从粗糙逐渐变光滑，其结果见图1(图1见文后彩插2)。

2.3各组小鼠肝组织病理学的分析

肝脏病理学研究结果显示：对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝索排列规则且以中心静脉放射排列，汇管区未见炎症细胞浸润。模型组小鼠肝细胞明显肿胀，肝小叶界限模糊，肝细胞内有成堆的脂肪滴，已呈现典型的酒精性脂肪肝病变。与模型组比较，四物汤低剂量组和中剂量组的脂肪变程度均有所改善，而高剂量组小鼠肝细胞肿胀减轻，少数肝细胞轻度水肿，肝小叶及汇管区未见炎性细胞浸润，脂肪变程度明显减轻(图2，图2见文后彩插2)。

3讨论

酒精过量引起的肝损伤已经成为严重的世界性公共卫生问题。酒精性肝病的发生与乙醇及其代谢产物的直接毒性、营养改变、脂质过氧化及遗传免疫因素等有关[9]，目前临床上仍以戒酒为主要的治疗手段，至今仍未找到有效的治疗靶点和方法，故寻找有效预防及延缓酒精性肝病发展的理想药物尤为重要[10]。近年来各类中药材以及从各类药学植物中提取的有效成分应用于酒精性肝病治疗逐渐成为研究热点。于海玲等[11]证实了由人参、川芎、白芍、胡桃仁及鸭肉等制备而成的肝康颗粒通过减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤，从而抑制酒精的肝毒性反应；付斌等[12]也证实了由灵芝、葛根、枳椇子、枸杞子为原料的护肝片能够减轻酒精对肝细胞的损伤；刘超群等[13]将大蒜中提取的大蒜多糖应用于酒精性肝损伤的治疗也得到了有效的结果。众所周知，四物汤是中医临床具有活血化瘀作用的基础方，常用于治疗可见血瘀证候的多种疾病。最新研究表明其具有消除自由基的作用[5]，而自由基在酒精性肝损伤的发病过程中起到关键的作用。但至今尚未见四物汤应用于酒精性脂肪肝治疗的报道。临床观察发现酒精性脂肪肝中医证候类型之“血瘀证”是其主要的证型，治疗可以四物汤为基础方以活血化瘀。

因此本实验应用四物汤对酒精中毒小鼠干预6周后，对各组小鼠体重增长量和肝指数结果分析显示：模型组小鼠体重增长量显著降低(P<0.05)，肝指数显著增加(P<0.05)，表明长期饮酒会降低小鼠食欲和对食物的吸收能力，同时肝脏组织存在受损肿胀情况。而四物汤各组结果与模型组相比较，小鼠体重增长量显著增加(P<0.05)，肝指数显著降低(P<0.05)，说明四物汤具有改善酒精中毒小鼠的食欲和吸收功能的作用，对肝脏肿胀情况有所改善。血清ALT和AST活性升高为肝细胞损伤的特异性指标，只要有1%的肝细胞坏死，便可使血中酶活性增高1倍。而肝脏病理学检查则被认为是判断肝脏损伤的金标准[14]。模型组小鼠血清中ALT、AST和TG与对照组比较均显著增高(P<0.05)；而四物汤各剂量组血清ALT、AST和TG含量与模型组比较均显著降低(P<0.05)，提示四物汤具有较强的抗酒精性肝脏损伤的效应。肝脏外观和肝脏病理学结果显示：四物汤从低剂量到高剂量对酒精性肝损伤有递增的改善作用，也说明四物汤对酒精性肝损伤出现的脂肪变性和炎症病理学改变具有抑制和减缓发展的作用。因此初步推断四物汤可能是通过改善微循环消除自由基而发挥抗酒精性肝损伤的效应，而作用机制还有待进一步深入研究。

总之，本实验应用四物汤干预小鼠酒精性肝损伤，表明四物汤具有抑制和减缓肝细胞脂肪变性、减轻炎症和修复肝脏细胞的作用，对乙醇诱导的小鼠酒精性肝损伤具有显著的保护作用，为ALD发病机制和临床治疗药物的研发开辟了新的实验平台。

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〔修回日期〕2014-10-20

简报