HPLC法同时测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

HPLC法同时测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

陈婷

(南京市中医院，南京210001)

摘要：目的建立同时测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的高效液相色谱方法。方法以Boston Green ODS C18为分析色谱柱，乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氢钠)(60∶40)等度洗脱，检测波长为 296 nm，柱温为 35 ℃作为色谱条件。结果华蟾酥毒基和酯蟾毒配基线性良好，各项方法学参数都达到定量要求，回收率分别为98.92%和99.04%，36 h内样品稳定性良好。结论该方法准确，操作较为简便易行，可用于蟾酥药材的质量控制。

关键词：蟾酥；华蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.010

中图分类号：R282文献标志码：A

收稿日期：(2015-04-18)

Simultaneous determination of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenumby HPLC

CHEN Ting(Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210001， China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of pureonebio and recibufogenin in Bufonis venenum. MethodsHPLC system consisted of Boston Green ODS C18 column，acetonitrile-water solution with-2 mL·L-1 phosphoric acid (60∶40) (0.02 mol·L-1 sodium dihydrogen phosphate ) as mobile phase. UV detection wavelength was set at 296 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.ResultsPureonebio and recibufogenin showed good linearity within the tested concentration scope. The method was validated and the recoveries of pureonebio and recibufogenin were 98.9% and 99.0%， respectively. The samples were stable within 36 h. ConclusionThis method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control for Bufonis venenum.

Key words:Bufonisvenenum；pureonebio；recibufogenin；HPLC

蟾酥(Bufonisvenenum)为蟾蜍科动物大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，扁圆形团块状或片状，呈红褐色或红棕色[1]。中医认为，其味甘、辛，性温，有毒，主治小儿疳疾、脑疳、背部疔疮及一切肿毒。除此之外，还有强心和止痛等作用[2]。其在临床上被广泛应用于治疗多种癌症、结核病、心脏病、恶性血液病、顽固性呃逆、周期性面部神经麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等，还可以用于局部麻醉[3]。

蟾蜍浆液即蟾酥中的苷元，都是有强烈药理作用的甾族，不少无药理作用的甾族和尚含有一定药理作用的吲哚系碱类成分。主要涉及:①蟾蛛毒素类，包括蟾毒、蟾毒配基脂肪酸酯和蟾毒配基硫酸酯等；②蟾毒配基类，是蟾蛛毒素在加工炮制过程中的分解产物，如酯蟾毒配基、华蟾毒精等[4-5]。

随着蟾酥的适用范围和使用手段日趋增长，对其药材的质量控制和检测方法需要不断地发展和提高[6]。因此，笔者收集到市场上的蟾酥样品，通过建立和优化HPLC检测手段，考察蟾酥样品的质量状况，为今后质量标准的提高和方法更新提供一定的实验基础。

1仪器与试药

1.1仪器Waters e2695高效液相色谱仪， 配Waters 2998检测器(美国Waters 公司)；Mettler ToledoXS105型电子分析天平(瑞士Mettler 公司)；超声波发生器(天津市恒奥科技发展有限公司生产)；Thermo Biofuge Primo R 低温高速离心机(美国Thermo公司)；Milli-Q 超纯水处理系统。

1.2试药蟾酥样品共10批次取样于江苏境内，均经南京市中医院药剂科鉴定为药典收载品种；华蟾酥毒基(批号110803-201406，质量分数99.6%)和酯蟾毒配基(批号110718-201108，质量分数98.9%)对照品，均购于中国食品药品检定研究院，达到定量分析的要求。实验所用甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；磷酸、磷酸二氢钠为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件Boston Green ODS C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm， 5 μm)；流动相为乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氢钠60∶40)，等浓度洗脱；流速为1 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；检测波长为296 nm。在此条件下，各色谱峰间分离度均达到定量要求，见图1。

图1 HPLC图

A. 对照品；B. 蟾酥样品；C. 空白对照；1. 华蟾酥毒基；2. 酯蟾毒配基

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances； B.sample； C.blank sample；1.pureonebio； 2.recibufogenin

2.2溶液制备对照品溶液的制备:取华蟾酥毒基和酯蟾毒配基约10 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为单一对照品储备液。精密量取各单一对照品储备液1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液，备用。

供试品溶液的制备:参照《中国药典》2010年版一部蟾酥药材含量测定项下方法，取10批蟾酥样品，量取各样品约25 mg，精密称定，置于具塞锥形瓶中，称定质量，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量， 摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，进样前用0.45 μm滤膜滤过。

2.3线性关系取2.2项下对照品储备液，用甲醇稀释成一系列质量浓度的对照品溶液，进样分析，以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。华蟾酥毒基的回归方程为:Y=7.463X-7.112(r=0.999 9)，线性范围为1.446～361.5 μg·mL-1；酯蟾毒配基的回归方程为:Y=6.226X-4.192(r=0.999 8)，线性范围为1.226～306.5 μg·mL-1。结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在各自的质量浓度范围内,线性关系良好。

2.4检测限与定量限将对照品溶液不断稀释后制得一系列不同质量浓度的溶液，进样分析后，以信噪比 S/N=3作为检出限， S/N=10作为定量限。华蟾酥毒基的检测限和定量限分别为0.482和1.446 μg·mL-1；酯蟾毒配基的检测限和定量限分别为0.409和1.226 μg·mL-1。

2.5 精密度实验取任一质量浓度的混合对照品溶液连续进样6针，以各针色谱峰的峰面积值计算 RSD，结果表明，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度RSD分别为0.99%和1.02%，均小于2.0%，精密度良好。

2.6回收率实验量取同一批蟾酥粉末6份，每份约12.5 mg(华蟾酥毒基含量约为28 mg·g-1；酯蟾毒配基含量约为15 mg·g-1)，精密称定，按照各自含量的80%精密加入混合对照品储备液适量，按照2.2供试品溶液的制备项下方法进行操作，进样测定。计算平均回收率，结果见表1。结果表明，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的平均加样回收率为98.92%和99.04%，RSD低于 3%，该方法准确度好，回收率达到定量要求。

表1样品回收率实验结果

Tab.1 The results of recoveries tests

成分编号称样量/mg原有量/mg·g-1加入量/mg·g-1测得量/mg·g-1回收率/%平均回收率/%RSD/%华蟾酥毒基112.4432326.01269.78588.4098.7698.920.79212.4432238.29190.82427.8699.71312.4800325.23269.78594.5999.93412.4800238.87190.82421.2298.03512.5003330.38269.78592.7298.76612.5003240.26190.82430.9599.97酯蟾毒配基112.4432238.29190.82427.8699.7199.040.82212.4432325.23269.78594.5999.93312.4800238.87190.82421.2298.03412.4800330.38269.78592.7298.76512.5003240.26190.82430.9599.97612.5003325.82269.78586.8498.53

2.7重复性实验量取同一批蟾酥粉末6份，每份约20 mg，精密称定，按照2.2项下供试品溶液的制备方法进行操作，进样测定。计算RSD。结果表明，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD分别为1.43%和0.92%，重复性良好。

2.8稳定性实验取同一批蟾酥粉末约20 mg，精密称定，按照2.2供试品溶液的制备项下方法进行操作，分别在0，1，2，4，8，12，24和36 h进样测定。结果表明，在36 h内，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD小于1.32%，基本稳定，不影响定量检测。

2.9样品测定取10个批次的蟾酥药材样品，按照2.2供试品溶液的制备项下方法进行制备，并且按照2.1色谱条件项下高效液相色谱方法检测，检测结果见表2，其中10批样品的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量均高于6.0%，达到《中国药典》2010年版一部相关项下的含量要求。

表2蟾酥样品中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量结果

Tab.2 The content results of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenum

( n=10)

3讨论

蟾酥作为毒性药材，并且鉴于其独特的功效特点，多年来一直在临床上不断地发挥着重要的治疗效果[7-8]。随着社会生态的变化以及对于蟾蜍科动物的捕杀，该药材的来源越来越局限，质量也在逐年下降。因此，针对市场对蟾酥的需求，不时的对市场中蟾酥药材进行质量检查，并对检测方法的要求提高，都是需要不断完善和反复验证的必经步骤。

本实验基于《中国药典》2010年版一部[9]相关方法，建立了同时测定蟾酥中2种主要成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的方法。同时对色谱条件和提取方法也进行了必要的优化。

笔者考察了《中国药典》2010年版一部中乙腈-5 mL·L-1磷酸二氢钾溶液(50∶50)(用磷酸调节pH值为3.2)的流动相；并且与乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氢钠)(60∶40)进行比较。结果表明，后者色谱峰峰形好，达到理想的分离度，配制较为简单，省去了调节pH的步骤，降低了人为实验误差。

笔者考察了《中国药典》2010年版一部中的回流提取方法，并且与超声提取方法相比较。综合考虑2种方法的稳定性、方便性和提取效率，最终选择甲醇超声30 min作为本实验的提取方法。该方法操作简便，重复性好，并且不影响定量结果的准确度。

参考文献：

[1]赵强，孟凡静，刘安西.蟾酥的研究进展[J].中草药， 2004,35(10): 4-7.

[2]姚绍柱，张秀清.蟾酥的采集加工技术及质量标准[J].西北药学杂志，1987,2(4):34.

[3]程国华.蟾酥质量研究及其药理临床应用进展[J].中草药， 2001,32(2): 184-186.

[4]辛秀兰，张宝璟，苏东海，等.中药蟾酥的药理作用研究进展[J].现代生物医学进展， 2012,12(3): 588-591.

[5]张鹏伟，江仁望，叶文才，等.中华大蟾蜍蟾酥中蟾毒内酯类化学成分研究[J].中国中药杂志， 2014,39(5): 841-845.

[6]李妍，王四旺，孙纪元，等.正交实验法优选蟾酥脂溶性成分提取工艺[J].西北药学杂志，2007,22(3): 112-113.

[7]夏俊，江敏，姜彦峰. 蟾酥及其有效成分体外抗肿瘤作用研究进展[J]. 现代肿瘤医学， 2008,16(8): 1441-1443.

[8]蟾酥质量研究及其药理临床应用进展[J].中草药， 2001,32(2): 184-186.

[9]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京:中国医药工业出版社，2010: 1067.