七氟醚对老龄大鼠海马CA3区突触结构的影响

韦晓勇，王　毅，闵红星，陆　波，李　军

七氟醚对老龄大鼠海马CA3区突触结构的影响

韦晓勇1，王毅2a，闵红星2a*，陆波2b，李军2b

[摘要]目的观察七氟醚对老龄大鼠海马CA3区突触结构的影响。方法健康SD大鼠60只，18月龄，随机分为4组：空白对照组(C组)、3%七氟醚组(S1组)、1.5%七氟醚组(S2组)、3%异氟醚组(I组)，每组15只。于麻醉结束后1、3、7 d (T1~T3)行Morris水迷宫实验，并测定海马CA3区突触结构各指标。结果与C组比较，I组T1~T3、S1组T1~T2时逃避潜伏期延长，穿越原平台象限次数减少，I组、S1组T1~T3海马CA3区突触间隙增宽，PSD厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小(P<0.05)；与I组、S1组比较，S2组T1~T2时逃避潜伏期缩短，T1~T3海马CA3区突触间隙变窄，PSD厚度增厚，突触活性区长度延长，突触界面曲率增大(P<0.05)；与I组比较，S1组、S2组T3时逃避潜伏期缩短，穿越原平台象限次数增加(P<0.05)；与S1组比较，I组T3时逃避潜伏期延长，穿越原平台象限次数减少(P<0.05)；与T1比较，I组、S1组、S2组T2~T3时逃避潜伏期缩短(P<0.05)。结论低浓度七氟醚对老龄大鼠认知功能无明显影响，高浓度七氟醚、异氟醚均可导致老龄大鼠认知功能减退，其机制可能与抑制海马CA3区突触结构的改变有关。

[关键词]七氟醚；认知障碍；海马；突触；异氟醚

[Abstract]Objective To observe the effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile rats. MethodsSixty healthy SD rats aged 18 months were randomly divided into 4 groups: blank control group(group C,n=15),3% sevoflurance group (group S1,n=15),1.5% sevoflurance group (group S2,n=15),3% isoflurane group (group I,n=15). The Morris water maze test was performed at the 1st,3rd and 7th day (T1~T3) after anesthesia,and the synaptic structure in hippocampal CA3 area was measured.ResultsCompared with group C,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T1~T3in group I and at T1~T2in group S1,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1~T3in group I and group S1(P<0.05);Compared with group I and group S1,the escape latency was shortened at T1~T2in group S2,the width of synaptic cleft decreased,the thickness of the postsynaptic density increased,the length of active zones was prolonged,and the curvature of the synaptic interface was increased at T1~T3in group S2(P<0.05);Compared with group I,the escape latency was shortened,the frequency of crossing the original platform increased at T3in group S1and group S2(P<0.05);Compared with group S1,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T3in group I (P<0.05);Compared with T1,the escape latency was shortened at T2~T3in group I,group S1and group S2(P<0.05).ConclusionSevoflurane of low concentration has no obvious effect on cognitive function in senile rats. Both sevoflurane and isoflurane of high concentration can induce the cognitive hypofunction in senile rats,and the mechanism may be associated with the inhibition of the changes of synaptic structure in hippocampal CA3 area.

收稿日期：2015-02-10

基金项目：国家自然科学基金青年基金(81102885)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201510002

Effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile ratsWEI Xiao-yong1,WANG Yi2a,MIN Hong-xing2a*,LU Bo2b,LI Jun2b(1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.a.Department of Anesthesiology,b.Department of Preventive Care,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Key words：Sevoflurane;Cognition disorders;Hippocampus;Synapses;Isoflurane

0引言

术后认知功能障碍(POCD)是老年患者术后常见的一种中枢神经系统并发症，临床表现为以记忆下降为主的认知功能减退[1]。大量研究表明，七氟醚麻醉可引起老年大鼠空间认知功能障碍[2-3]。前期研究结果表明，高浓度七氟醚可引起老龄大鼠早期空间学习和记忆能力一过性下降，但未阐明机制[4]。突触是神经元之间传递信息的重要结构，海马不同区域的功能不尽相同，其中CA3区在学习记忆中起重要作用[5]。因此，本研究拟通过观察七氟醚对老龄大鼠海马CA3区突触结构的影响，探讨七氟醚导致认知功能减退的可能机制。

1材料与方法

1.1动物选择及分组健康雄性SD大鼠60只(由宁夏医科大学动物实验中心提供，清洁级，合格证号：SCXK(宁)2011-0001)，18个月龄，体重450~500 g，随机分为4组：空白对照组(C组)、3%七氟醚组(S1组)、1.5%七氟醚组(S2组)、3%异氟醚组(I组)，每组15只。

1.2主要药品及仪器七氟醚(鲁南贝特制药有限公司，批号：65130101)，异氟醚(鲁南贝特制药有限公司，批号：110408)，Morris水迷宫视频跟踪系统(成都泰盟科技有限公司)，麻醉气体监测仪(Drager infinity kappa，德国)，麻醉机(Drager，SA2-C型，德国)，H-7500型透射电镜(Hitachi公司，日本)，生物安全柜[力康HealForce，A2型，力新仪器(上海)有限公司]。

1.3麻醉方法自制透明麻醉箱，为透明玻璃材质，体积为40 cm×30 cm×25 cm，麻醉箱30 cm×25 cm的两侧壁中线距上下顶底5 cm处各有一孔，一孔接麻醉机，另一孔连接麻醉气体监测仪，麻醉时在箱底部铺设一薄层钠石灰，吸收二氧化碳，防止麻醉过程箱内二氧化碳蓄积影响实验结果，并在钠石灰上平铺一层医用纱布，防止大鼠吸入钠石灰粉尘和灼伤四肢皮肤。每组随机取6只大鼠进行Morris水迷宫适应性训练3 d，之后将其与每组剩余的大鼠分别置于自制的循环密闭麻醉箱中，并把麻醉箱放于生物安全柜中，以便收集废气，麻醉箱连接于麻醉呼吸机螺纹管回路中，麻醉呼吸机工作状态为手控模式，调节排气阀至最小压力，调节七氟醚挥发罐输出浓度为3%行麻醉诱导，吸入氧浓度40%，麻醉机输出气体总流量2 L/min,接气体监测仪监测麻醉箱内氧气、二氧化碳、七氟醚的浓度。待大鼠翻正反射消失后，S2组调节七氟醚挥发罐使箱内七氟醚浓度达1.5%，吸入2 h，观察大鼠皮肤颜色，监测呼吸频率、心率和脉搏血氧饱和度，之后将大鼠置于氧浓度约为40%的环境中任其自然苏醒，之后回笼饲养，自由取食。S1组、I组方法同上，分别调节七氟醚、异氟醚挥发罐，维持箱内七氟醚、异氟醚浓度均为3%，吸入2 h。C组只吸入含有40%氧气的空氧混合气体2 h。维持麻醉箱温度(25±1)℃。

1.4行为学测试于麻醉结束后1、3、7 d (T1~T3) 3个时段，将每组适应性训练后的6只大鼠分别行Morris水迷宫测试，具体过程参照文献[4]，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)，如果在120 s内未到达平台，则由实验者将其引至平台，逃避潜伏期记为120 s，每次训练间隔1 min。取大鼠4次逃避潜伏期的平均值，作为其该日的学习成绩，即逃避潜伏期(s)。定位航行实验结束后撤除平台，将大鼠于原平台象限池壁中点背向池壁放入水中，记录120 s内穿越原平台象限的次数。

1.5电镜观察于上述3个时段每组随机取3只大鼠，10%水合氯醛(0.4 mL/100 mg)腹腔注射麻醉下，待大鼠翻正反射消失后，开胸，暴露心脏，经升主动脉依次灌注4%多聚甲醛和生理盐水，灌注结束后快速断头取脑，并在冰盘上分离海马组织，置于2.5%戊二醛中固定，4 ℃过夜。参照边缘系统解剖图谱切取左侧海马CA3区1 mm×1 mm×1 mm组织块，l%锇酸固定l h，常规乙醇、丙酮脱水、透明，Epon 812包埋，制备厚度约70 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色。采用H-7500型透射电镜(Hitachi公司，日本)下进行观察，取40 000倍放大倍数，每张切片随机选5个视野，采用多点平均法测量突触间隙宽度，参照文献[6]介绍的方法，测量突触后膜致密物(PSD)厚度、突触活性区长度及突触界面曲率(突触界面弧长与弦长之比)。

2结果

与C组比较，I组T1~T3、S1组T1~T2时逃避潜伏期延长，穿越原平台象限次数减少(P<0.05)；与I组比较，S2组T1~T3、S1组T3时逃避潜伏期缩短，穿越原平台象限次数增加(P<0.05)；与S1组比较，S2组T1~T2时逃避潜伏期缩短，I组T3时逃避潜伏期延长，穿越原平台象限次数减少(P<0.05)；与T1比较，I组、S1组、S2组T2~T3时逃避潜伏期缩短(P<0.05)，见表1。

与C组比较，I组、S1组T1~T3海马CA3区突触间隙增宽，PSD厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小，差异有统计学意义(P<0.05)；S2组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与I组、S1组比较，S2组T1~T3海马CA3区突触间隙变窄，PSD厚度增厚，突触活性区长度延长，突触界面曲率增大，差异有统计学意义(P<0.05)；I组与S1组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1　四组大鼠各时段逃避潜伏期和穿越平台次数比较

注：*与C组比较，P<0.05；#与I组比较，P<0.05；&与S1组比较，P<0.05；△与T2比较，P<0.05

表2　四组大鼠各时段海马CA3区突触结构参数的比较

注：*与C组比较，P<0.05；#与I组比较，P<0.05；&与S1组比较，P<0.05

3讨论

Morris水迷宫是用于评估啮齿类动物学习记忆功能的重要工具，已成为一种研究空间学习和记忆机制的标准工具[7]。前期研究发现，七氟醚和异氟醚对老龄大鼠的学习和记忆均有影响，且异氟醚较七氟醚对学习和记忆的影响恢复慢[4]。吸入麻醉药对老年大鼠的学习记忆功能影响的发病机制尚无定论[8]。研究表明，海马区域是重要的学习与记忆的存储结构[9-10]，特别是CA3区与年龄相关性认知功能损害有关[11]，突触是神经元之间进行信息交流的关键部位[12]，其可塑性是突触发育及神经通路重塑的先决条件，是学习和记忆的形态学基础[13]。因此，本研究采用Morris水迷宫实验观察吸入麻醉药七氟醚及异氟醚对老龄大鼠认知功能障碍的影响，并通过电镜测定海马CA3区突触结构各参数的变化，以探讨其可能的相关机制。本研究以逃避潜伏期测量大鼠的学习能力，以穿越原平台象限次数测量大鼠的记忆能力。结果显示，与C组比较，S1组、I组逃避潜伏期延长，穿越原平台象限次数减少，S2组各指标比较差异无统计学意义；与I组、S1组比较，S2组逃避潜伏期缩短，穿越原平台象限次数增加，由此提示，低浓度七氟醚对老龄大鼠认知功能无明显影响，高浓度七氟醚、异氟醚均可导致老龄大鼠认知功能减退。

突触是神经元与神经元之间以及神经元与效应细胞之间相互联系和信息传递的结构，是神经系统可塑性变化最敏感的部位[1,6]，其功能及结构完整性对维持大脑功能的正常至关重要。突触前膜和突触后膜之间的狭窄间隙称为突触间隙，其内含有包含物、微丝、突触间丝及特异性S-100蛋白质等。有报道，突触间隙增宽，影响间隙内某些包含物的合成及其与递质间的结合，并且影响S-100蛋白质与钙离子的接触，导致神经冲动传导受阻，学习记忆能力下降[14]。PSD是位于突触活性区突触后膜下方与胞质相连的一层致密物质，由细胞骨架蛋白与调节蛋白组成，其含有多种蛋白质、酶及离子通道，这些物质构象或数量的变化均可引起PSD 超微结构的变化，即厚度的改变，其厚度与神经运动功能和学习记忆的保持能力密切相关[15]。突触前膜与聚集成簇的突触小泡相接触形成突触活性区，其长度反映神经递质释放的有效面积，且PSD厚度变化影响突触可塑性[12]，进而影响中枢神经系统的信息传导。突触界面曲率为活性区弧长与其相对应弦长之比，是突触可塑性的潜在性特征，其增大可加大突触间的接触面，提高神经信息传递的有效性。

本研究结果表明，与C组比较，Ⅰ组、S1组T1~T3海马CA3区突触间隙增宽，PSD厚度变薄，突触活性区长度缩短，突触界面曲率减小，S2组与C组比较差异无统计学意义，提示高浓度七氟醚、异氟醚均可引起老龄大鼠海马CA3区突触结构的损伤。研究发现，异氟醚主要对PSD和突触间隙宽度产生影响[14]，七氟醚可引起大鼠海马内PSD蛋白质表达下调，造成长期的空间学习和记忆损害[16]。因此，推测高浓度七氟醚、异氟醚导致老龄大鼠认知功能减退，其机制可能与抑制海马CA3区突触结构的改变有关。

综上所述，低浓度七氟醚对老龄大鼠认知功能无明显影响，高浓度七氟醚、异氟醚均可导致老龄大鼠认知功能减退，其机制可能与抑制海马CA3区突触结构的改变有关。

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作者单位：1.南京中医药大学附属医院，南京 210029；2.南京中医药大学，南京 210023