bFGF在百草枯诱导大鼠肺纤维化过程中的表达

徐宏业，乔博亚，张　杰，鲍志宇，秦豪杰，莫耀南



bFGF在百草枯诱导大鼠肺纤维化过程中的表达

徐宏业1，乔博亚2，张杰1，鲍志宇1，秦豪杰1，莫耀南1

摘要：目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在百草枯诱导大鼠肺纤维化组织中的表达及其作用。方法健康清洁雄性SD大鼠45只，体质量(350±20) g，分为实验组和对照组。实验组大鼠腹腔注射10 mg·kg-1百草枯溶液，对照组大鼠注射等渗盐水。实验组大鼠分为1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d组，每组5只，按观察时间分批处死，对照组大鼠饲养28 d后处死。观察每组大鼠肺形态学变化，肺组织苏木精-伊红(HE)和Masson染色，免疫组化SP法检测bFGF在大鼠肺组织中的表达。 结果染毒后大鼠出现异常行为变化；肺组织3 d出现中性粒细胞浸润，5 d时胶原纤维增生，14 d时肺泡周围不规则胶原纤维明显增多，28 d时肺明显纤维化，胶原纤维广泛分布。bFGF免疫组化染色示染毒大鼠支气管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性细胞以及肺泡腔内的巨噬细胞内bFGF呈阳性表达，且随着时间变化，其表达逐渐增高，而至28 d时稍减弱。结论百草枯中毒后肺纤维化，随着时间的推移程度不断加深。bFGF在百草枯大鼠肺纤维化过程中表达上调，至28 d时稍减弱，其可能参与百草枯大鼠肺纤维化过程，其机制有待于进一步研究。

关键词：百草枯；肺纤维化；大鼠；bFGF

百草枯(paraquat,PQ)，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，分子式为C12H14N2’2Cl，分子量为257.2 Da。PQ是有机杂环类接触性除草剂，因其除草效果良好而在我国农村被广泛使用。但自PQ使用以来，世界各地出现大量的中毒病例，甚至在亚洲、加勒比海地区和太平洋岛国，口服百草枯成为一种常见的自杀方式[1-3]。PQ有着极强的毒性，且没有有效的治疗方式，致死率很高。Hwang等报道PQ中毒的病死率为40%～50%，国内为85%～95%，肺是百草枯作用的主要靶器官，其机制是百草枯毒素在富氧的肺组织中氧化，中性粒细胞大量积聚，产生大量的氧自由基，造成肺泡的损伤。主要表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡出血、水肿，炎性细胞浸润，晚期则出现肺不可逆性纤维化。而且，百草枯中毒非急性死亡的病人大多在15～30 d发生肺纤维化。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员，它在人体中的分布非常广泛，主要分布于脑、肝、心脏、肾、骨、甲状腺、软骨等组织，还分布于单核巨噬细胞、肝细胞、成肌细胞和星形细胞等。纯化的bFGF是一条单链，含有146个氨基酸，其基因位于人类染色体的4q25处，基因长约38 kb[9-10]。bFGF具有强大的促进细胞分裂增殖的作用，能够促进成纤维细胞的增生和胶原纤维的合成、可以激活内皮细胞合成细胞外基质等[11]。基于bFGF的功能作用，其在百草枯致肺纤维化过程中可能具有一定的意义。

本实验通过建立百草枯诱导肺纤维化模型， HE及Masson染色观察其组织病理学改变，应用免疫组织化学技术检测bFGF在大鼠肺组织中的表达，探讨百草枯致肺纤维化的病理过程及bFGF在其中的可能机制，为后续进一步的百草枯中毒机制研究奠定基础。

1材料和方法

1.1实验动物与材料健康清洁雄性SD大鼠45只，体质量(350±20) g ，由河南科技大学医学动物实验室提供。百草枯纯品购于美国Fluka公司，Masson染色试剂盒购于北京Solarbio科技有限公司，兔抗大鼠bFGF多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，兔Streptavidin-HRP试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2模型建立健康清洁雄性SD大鼠 45只，分为1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d组和空白对照组，每组5只。实验组大鼠腹腔一次性注射百草枯溶液，给药剂量为10 mg·kg-1；对照组大鼠同样方法腹腔注射等渗盐水。观察大鼠染毒后的行为学改变，每天2次。实验组大鼠分别于第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d分批处死，对照组大鼠饲养28 d后处死。所有大鼠脱颈处死后剖胸观察肺外观并取出肺，4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，切片(片厚4 μm)，苏木精-伊红(HE)和Masson染色观察肺组织病理学改变和肺纤维化情况。

1.3免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡、水化，经抗原修复(0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液，微波热修复)、3% H2O2孵育去除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液。每片滴加bFGF多克隆抗体(1∶300稀释)50 μL，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3 min×3次。每片滴加生物素标记的二抗工作液50 μL，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3 min×3次。每片滴加HRP标记的链酶亲和素50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次。DAB显色3 min。苏木素复染，中性树胶封固。阴性对照用PBS替代一抗。

2结果

2.1大鼠行为学观察正常对照组大鼠活泼好动，肥硕强壮。实验组大鼠染毒6 h后即出现呼吸急促，鼻翼扇动明显，少活动，呈匍匐状态，腹式呼吸明显而幅度大；且随着染毒时间的延长，动物出现前爪抹鼻，毛发缺乏光泽且直立不倒伏，食欲差；部分大鼠动作迟缓，活动减少，出现皮肤发绀，神志差，走路左右摇晃不定、小心翼翼等症状。

2.2肺组织形态观察正常对照组大鼠肺部呈鲜红色，质地柔软，切面无出血。实验组大鼠在腹腔注射百草枯1～3 d，肺体积稍增大，肺边缘变钝圆，质地柔软，呈红褐色，散在点养廉瘀斑，轻触后切面有泡沫状液体渗出；腹腔注射百草枯5～14 d，肺组织有不同程度的萎缩，颜色暗红，质地稍硬，轻触后切面有较少的液体渗出；腹腔注射百草枯21～28 d，肺组织萎缩严重，部分肺组织表面凹凸不平，质地变硬，颜色苍白，肺部分区域出现明显的瘢痕组织。

2.3肺组织HE与Masson染色HE染色结果显示，1 d组大鼠肺组织除肺间质小血管及肺泡壁毛细血管扩张充血外，其余与正常对照大鼠肺组织没有明显差异；Masson染色显示肺间质除部分细支气管周围外未见有胶原纤维。3 d组大鼠肺组织HE染色显示肺泡隔增宽，肺间质小血管及肺泡壁毛细血管扩张充血，少量炎性细胞浸润，部分肺泡腔内见大量淡红染水肿液；Masson染色显示肺泡隔内未见有明显胶原纤维。5 d组大鼠肺组织HE染色显示肺泡隔增宽，炎性细胞增多，部分肺泡腔内出血；Masson染色显示肺泡隔内有少量淡蓝色胶原纤维。7 d组大鼠肺组织HE染色结果基本与5 d组相同，肺间质有大量炎性细胞浸润，部分肺泡萎陷；Masson染色显示肺泡隔中显蓝色的胶原纤维增多。

10 d组大鼠肺组织HE染色显示肺泡隔增粗明显，部分肺泡腔萎陷，大量炎性细胞浸润；Masson染色显示肺泡隔胶原纤维增多。14 d组大鼠肺组织HE染色显示肺泡间隔进一步增宽，间质小血管淤血明显，部分肺泡萎陷实变(见图1)；Masson染色显示肺泡隔内胶原纤维较前增多(见图2)。

图2　染毒14 d，肺间质胶原纤维增多(Masson，×100)

21 d组大鼠肺组织HE染色显示肺组织实变，肺泡形态已不易分辨；Masson染色显示肺组织实变，大量胶原纤维沉积。28 d组大鼠肺组织HE染色显示肺组织实变严重，难见到正常的肺泡腔(见图3)；Masson染色显示胶原纤维广泛分布，呈不规则排列，肺纤维化明显(见图4)。

2.4bFGF在肺组织表达免疫组化染色结果显示大鼠肺组织内bFGF多克隆抗体阳性表达产物呈棕黄色细颗粒状，阴性对照均未见阳性表达。空白对照组在支气管黏膜上皮、支气管平滑肌和肺泡上皮有少量弱阳性表达，肺间质内未见阳性表达(见图5)。实验组大鼠在染毒初期bFGF的分布与表达强弱与正常对照组相比未见明显差异。染毒5 d后 bFGF在支气管黏膜上皮、肺泡壁上皮等处呈阳性表达，在部分炎性细胞及肺泡巨噬细胞质内呈弱阳性表达(见图6)。随着染毒时间的延长，阳性反应逐渐增强，染毒14 d后，bFGF在支气管黏膜上皮、肺泡上皮及部分区域肺泡间质等处呈强阳性表达，在部分血管壁平滑肌及炎性细胞胞质内呈阳性表达(见图7)。染毒28 d后，肺组织实变明显，bFGF表达较前减弱，主要分布于支气管黏膜上皮、部分血管壁平滑肌及炎性细胞胞质内(见图8)。

图3　染毒28 d，肺组织实变(HE，×100)

图4　染毒28 d，肺实变，可见大量胶原纤维(Masson，×100)

图5　bFGF在正常大鼠支气管黏膜上皮、支气管平滑肌和

图6　染毒5 d，bFGF在支气管黏膜上皮、肺泡壁上皮等处

图7　染毒14 d，bFGF在支气管黏膜上皮、肺泡上皮及部分

图8　染毒28 d，bFGF表达较前稍减弱(SP，×400)

3讨论

百草枯是一种在我国应用比较广泛的除草剂，其中毒可引起多种脏器的损害，尤其以肺脏损害最为严重，急性期可导致肺充血、急性水肿，肺透明膜形成、增生变性等[12]，非急性死亡的病人大多在中毒后15～30 d发生肺纤维化，预后较差。本研究PQ中毒大鼠表现出动作迟缓，自主活动能力降低，活动减少，震颤、竖尾、竖毛。

HE和Masson染色显示随着染毒时间的延长，肺组织的损伤越来越重。在中毒早期(染毒1～3 d)，主要表现为急性肺淤血、急性肺水肿，部分肺泡腔内可见少量出血，中性粒细胞开始增多。在中期(染毒5～14 d)，随着时间的延长，出现慢性炎症，局部区域可见纤维组织增生。其机制可能是过量的氧自由基生成并诱导了炎性因子的损害作用，肺表面活性物质在不断减少，而胶原纤维在不断增生，导致肺萎缩、塌陷，弹性降低，肺的呼吸作用不断丧失，最终会出现明显纤维化。在终末期(染毒21～28 d)，肺组织大部分区域肺泡萎陷实变，大量胶原纤维沉积，最终形成纤维化。其结果和部分研究[5-7]基本一致，但从前期预实验结果来看，使用纯品百草枯染毒大鼠时使用剂量更易控制，实验动物死亡率也明显降低，故使用百草枯纯品来制作肺纤维化模型更适宜于进一步实验研究。

bFGF是一种能广泛地促进来源于中胚层及神经外胚层细胞增殖的生物活性物质，其生理功能相当广泛。其生物活性不仅能够促进神经组织、软组织等的损伤修复，促进新生血管形成，神经营养及肢体再生等等，它与器官纤维化的关系近年来亦引起关注。已有研究表明，肝纤维化[13]、肾纤维化[14]、系统性硬化症[15]等均与bFGF有关，且对纤维化有促进作用。bFGF对成纤维细胞有着强烈的促增殖效应。本组中bFGF在大鼠染毒5 d后表达开始升高，并且随着染毒时间的延长，阳性表达逐渐增强，至染毒28 d后，肺组织实变明显，bFGF表达较前有所减弱。这与成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积的过程基本一致，说明bFGF参与了大鼠肺纤维化的发生、发展过程。也即在损伤、炎症的刺激作用下，支气管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性细胞以及肺泡腔内的巨噬细胞内bFGF表达水平上调，促进肺组织内成纤维细胞增殖并分泌胶原纤维，最终促使肺纤维化形成，其具体机制有待于进一步研究。

综上所述，本实验成功建立了百草枯致大鼠肺纤维化模型，并且随着时间的推移，百草枯诱导的大鼠肺纤维化程度不断加深。而且，bFGF在百草枯大鼠肺纤维化过程中表达上调，至28 d时稍减弱，提示bFGF可能参与百草枯大鼠肺纤维化过程，其机制有待于进一步研究。

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Expression of bFGF in Process of Pulmonary Fibrosis

Induced by Paraquat in Rats

XU Hong-ye,QIAO Bo-ya,ZHANG Jie,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the model of pulmonary fibrosis by paraquat(PQ) in rats and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in the pulmonary fibrosis induced by PQ.Methods45 healthy male SD rats were divided into 1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d,21 d,28 d, and blank control group with 5 rats in each group. Rats in the experimental group were intraperitoneally injected with 10 mg·kg-1PQ solution, and the control group was injected isotonic saline solution. Rats in the experimental group were sacrificed at observation time, and the control group was fed 28 d. The pulmonary morphology changes, hematoxylin eosin staining (HE) and Masson staining of lung tissues were observed, and the immunohistochemistry method was used to detect the expression of bFGF protein in lung tissues of rats.ResultsAfter exposure of PQ the rat appears abnormal behavior in experimental group. The neutrophil infiltration were observed in rats after exposure of PQ 3 d, and proliferation of fibroblasts after 5 d, and the irregular collagen fibers were obviously increased surrounding the alveolar after 14 d. Pulmonary fibrosis was formed obviously after 28 d. In the experimental group,the positive expression of bFGF was found in the cytoplasm of inflammatory cell, bronchial mucosal epithelium and alveolar wall. Furthermore, the positive expression of bFGF was increased with exposure time until to 28 d, and then that was slightly decreased.ConclusionThe typical pulmonary fibrosis was induced by PQ poisoning, and the degree of pulmonary fibrosis

河南科技大学大学生研究训练计划项目(2014240)

作者单位：1.河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003

2.商丘市公安局梁园分局，河南商丘 476000

was continuously aggravated with exposure time. The expression of bFGF was increased with exposure time of PQ until to 28 d, and then that was decreased. Its mechanism need to be further studied.

Key words:paraquat；pulmonary fibrosis；rat；bFGF

通信作者：莫耀南，男，教授，E-mail：forensic@haust.edu.cn

作者简介：徐宏业(1990-)，女，河南南阳人，从事法医病理学研究工作。

收稿日期：2015-09-01

基金项目：河南省教育厅基础研究项目(14B310001)

中图分类号：R595.4,R563.9

文献标志码：A

文章编号：1672-688X(2015)04-0244-05