基于LC-MS技术修饰核苷作为肿瘤标志物的研究进展

张剑英，徐笑红

(浙江省肿瘤医院 检验科，浙江 杭州 310022)

基于LC-MS技术修饰核苷作为肿瘤标志物的研究进展

张剑英Δ，徐笑红

(浙江省肿瘤医院 检验科，浙江 杭州 310022)

修饰核苷是RNA的代谢产物，目前认为是一种广谱的潜在肿瘤标志物(tumor marker，TM)，在肿瘤患者尿液中排放量较正常人显著升高。液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技术结合了色谱的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点，已逐渐成为修饰核苷分析的的主要技术平台之一。本文综述了近年来LC-MS 技术在尿液修饰核苷分析方面的现状与进展，并对其发展前景进行展望。

修饰核苷；肿瘤标志物；液相色谱-质谱联用； 综述

肿瘤标志物(tumor marker，TM)对肿瘤的早期诊断、预后判断、治疗指导及复发和转移的监测都有重要作用。 修饰核苷是RNA的代谢产物，属于内源性小分子，利用修饰核苷作为各种恶性肿瘤的潜在标记物已成为近年来研究的热点。液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技术不需要对样品进行衍生化预处理，经济实用，适用于热不稳定，不易挥发，不易衍生化的物质。质谱(mass spectrometry，MS)技术的多通道监测功能与液相色谱(liquid chromatography，LC)技术的卓越分离能力，使LC-MS技术对检测样品的浓度和纯度要求都很低，甚至对痕量物质，也能通过优化MS扫描模式，给出可视化响应。因此，已经成为尿液修饰核苷的定性定量分析的主要技术平台。本文就近年来LC-MS 技术在尿液修饰核苷分析方面的现状与进展进行综述。

1 修饰核苷的来源和代谢

修饰核苷是机体RNA的代谢产物，是在转录后由多种特定的甲基转移酶和连接酶作用于多聚核苷分子而形成的。例如：碱基甲基化，碱基乙基化[1]，碳氢键重排，尿苷移位等。RNA包含大量的修饰核苷，在已经报道的100多种修饰核苷中，其化学修饰都需要特定的酶来完成的。修饰核苷是在正常核苷的基础上进行甲基化或其它的修饰，修饰的位置可能在糖苷键、糖羟基、碱基或者是碱基和糖羟基都被修饰，RNA修饰的位置是固定的，位置不正确的修饰核苷阻碍了细胞功能的正常的发挥。修饰核苷的独特性决定了真核细胞的修饰需要100多种功能各异的酶来完成，其作用与维系自身结构和调节功能有关[2]。

在人和动物体内，正常未被修饰的核苷可以在酶的作用下，被磷脂化后再利用形成新的RNA，或降解为尿酸和β-丙氨酸。修饰核苷结构十分稳定，受外界影响因素少，既不能被磷酸酯化再利用也不易代谢，在尿中其排量恒定。在各种RNA中，转运核糖核酸(tRNA)的含量最多(79种)[3]，因此尿中修饰核苷反映了有机体中tRNA的降解速率，进而提示体内细胞增殖情况。修饰核苷在正常成年人中排放恒定，几乎不受性别、年龄、饮食的影响。而婴儿和孕妇的排放水平较不稳定，其中婴儿体内修饰核苷的排放量是成年人的6～10倍，可能与组织细胞的生长速度关系比较密切。此外，在一些疾病状态下，例如炎症性疾病、免疫性疾病，特别是泌尿系统感染时，尿液中修饰核苷的排放量会发生变化。

2 尿液修饰核苷作为肿瘤标志物的研究

TM根据其生化属性及生理功能大体上可分为蛋白类标记物、基因类肿瘤标记物和内源性小分子类肿瘤标志物。内源性小分子是一种新型肿瘤标志物，它们与机体代谢密不可分。RNA修饰核苷属于内源性小分子，尿中修饰核苷的排放水平可以反应机体细胞RNA的代谢速度以及细胞的增值情况。正常成年人由于细胞增殖处于相对稳定状态，每天随尿液排出的修饰核苷量也相对稳定；肿瘤细胞的增值比正常细胞快,导致修饰核苷的产生和排出增多。恶性增殖是肿瘤细胞的共同特点，当机体细胞发生癌变时，可以通过检测尿中修饰核苷的含量，推测体内是否存在肿瘤，而不受肿瘤的病理类型及分化程度的影响。肿瘤患者尿液RNA修饰核昔含量高于正常人，原因主要有2个方面：①恶性肿瘤的大量细胞处于旺盛生长状态，核酸代谢及蛋白合成速度加快，RNA代谢加快，修饰核苷产生增多；②有研究认为恶性肿瘤细胞中存在高活性的tRNA修饰酶[4]，可对正常结构的tRNA进行高度修饰产生异常tRNA，后者代谢过程中即可产生大量修饰核苷。

近年来的研究结果表明修饰核苷是一类非常有潜力的TM，在多种常见类型肿瘤患者尿液中排放水平较正常人显著升高[5-7]。尿液修饰核苷具有其他TM所不具备的特征：①具有稳固的分子结构，不容易发生反应和改变形态；②尿液样本方便易得，具有无创性，可连续取样，便于跟踪监测；③可识别的肿瘤谱系广；④除了婴儿和孕妇外，修饰核苷在正常成年人中排放恒定，几乎不受性别、年龄、饮食的影响[8]。作为肿瘤筛查和诊断的手段，尿液修饰核苷可与蛋白类和基因类TM互补，补充这两种标记物肿瘤谱窄、肿瘤敏感性不高的不足，其临床应用前景广阔。

3 LC-MS在尿液核苷检测的应用

目前，尿液修饰核苷的分析手段主要有免疫分析法、气相色谱(gas chromatography，GC)法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法、高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)法、和LC-MS等。免疫分析法尿中核苷组分和其他成分会发生交叉反应，减少了定量分析的准确度，且该技术无法一次实现大量核苷组分的测定；GC法由于受挥发性的限制,虽然经过了化学衍生,也无法检测到一些高度修饰的核苷；HPLC 法和HPCE法的定量检测重现性较差。LC-MS技术不仅具有很高的灵敏度,而且具有广泛的适应性、选择性和高通量的特点，可以对大量的修饰核苷进行定性和定量,已逐渐成为修饰核苷分析的的主要技术平台之一。

3.1 样品采集和预处理 尿液标本由于采集容易,对患者无创伤性,也不会产生应激反应，实验中得到的数据比较可靠。首先需要采集足够数量的样本，从而有效减少源于尿液样本个体差异对分析结果的影响，得到有统计学意义的分析数据。早期研究尿中修饰核苷需要收集24h尿液，现有的研究表明用“随机尿样”检测，以核苷含量(nmol)/肌酐(μmol)作为标准可取得与24h尿样一样的结果，大大方便了核苷的检测。当分析的化合物在紫外线下不稳定时，需要在尿液中加入抗氧化剂。此外，需要长期保持的标本还需加入防腐剂。Rodriguez-Gonzalo等发现修饰核苷在长期的冻融循环条件下仍能保持稳定性[9]。由于尿中多达上万种化学物质, 核苷的含量很低,其他成分的干扰太多,无法直接对样品进行分析，需要对样本进行预处理。除了简单的离心除去沉淀，最常用固相萃取(solid phase extraction，SPE)技术除去蛋白和盐类。SPE技术具有污染小、回收率高、溶剂量小的优点，目前已广泛用于尿液核苷的分析。

在影响SPE效率的因素中，吸附剂的选择是至关重要的影响因素。早期最常用PBA作为吸附剂来分离提取尿中核苷成分[10]，该材料为一种硅胶型吸附剂，含有苯硼酸官能团, 对顺式二醇类化合物具有高的选择性和分离富集功能,最大的缺点是对尿液中其他结构核苷的提取有很大局限性。阳离子交换固相萃取能弥补这一缺陷，吸附剂含有硫酸官能团，能萃取所有酸性含氮核苷。有研究发现，与PBA萃取小柱比较，利用 Oasis HLB(二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物)萃取小柱能获得更多种类的核苷，该类型吸附剂为适合于酸性，中性和碱性化合物的通用型吸附剂，已成为核苷提取的最重要的萃取吸附剂之一。除了上述离线萃取技术，在线样品萃取技术结合高效液相色谱联用的方法结合了二者的优势, 目前在修饰核苷的分析中得到了广泛的应用。Rodriguez-Gonzalo等利用N-乙烯基乙酰胺共聚物萃取小柱在线萃取，ZIC-HILIC 亲水色谱串联质谱的方法检测了核苷和脱氧核苷[9]。Tuytten等[11]同样利用硼酸亲和柱在线萃取、HILIC 亲水色谱串联质谱的方法检测了修饰核苷。在线SPE技术将萃取净化和HPLC 和MS 分析结合用于样品的直接分析，可以提高方法的重现性和灵敏度,减少人为干预, 分析数据的质量也会显著提高。

3.2 基于LC-MS的数据采集 LC-MS 联用技术由液相色谱、接口装置、质谱3大系统组成。要想实现LC 和MS 的联用，接口装置是关键。LC-MS离子源主要起到使化合物离子化的作用并作为液相和质谱联用的接口，主要有大气压离子源(atmospheric pressure ionization，API)、快原子轰击源(fast atomic bombardment，FAB)和基质辅助激光解析电离源(matrix assisted laser ionization source，MALDI)3种电离方式。其中API包括电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)、大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)和大气压光电离(atmospheric-pressure Photoionization，APPI)3种离子源，这3种模式的样品离子化都可以在大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性[12]。在目前报道的尿液核苷的相关研究中，主要有FAB、MALDI和ESI 3种离子源，均为软电离方式。其中ESI适用于从中等极性化合物到高极性化合物的大分子物质,是目前报道的核苷定量分析利用最多的离子化方式,可以很方便地与其他分离技术联接，如液相色谱、毛细管电泳等，可方便地纯化样品用于质谱分析。其主要优点是：离子化效率高；离子化模式多，正负离子模式均可以分析；可与大流量的液相联机使用；通过调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。在修饰核苷的分析过程中，大多数报道都利用ESI正离子模式, ESI源的正离子模式产生的离子信号强度远远强于负离子模式[13]。

质量分析器是质谱仪中最核心最重要的部分，按采集离子的原理可分为连续检测离子的质谱仪和脉冲式质谱仪。所谓的连续检测离子的质谱仪则主要是通过扫描的方法去检测连续生成的离子主要包括三重四级杆质谱(triple quadrupole mass spectrometry，QqQ-MS)、磁质谱等；脉冲式质谱仪即是一类需要利用脉冲或门控形成离子,或者是采用离子注入等方式来检测离子主要包括飞行时间质谱(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)、傅里叶变换回旋共振质谱(fourier transform cyclotron resonance mass spectrometry，FTICR-MS)、离子阱质谱(ion trap mass spectrometry，IT-MS)等。在修饰核苷的LC-MS分析中，常见的质量分析器是QqQ-MS、TOF-MS以及IT-MS。最初，离子源的类型与分析仪的类型必须是匹配的，比如MALDI离子源只能与TOF分析仪连接。随着分析技术的不断发展，各种类型的离子源可以与不同类型的分析仪连接。Bond等[1]利用3种不同的方法分析尿液中修饰核苷：气相色谱质谱连用仪(GC/MS)、高效液相色谱离子阱质谱联用仪(HPLC/IT-MS)和毛细管液相色谱三重四极杆质谱联用仪(CAPLC/QqQ-MS)。经过比较发现, GC/MS的灵敏度比HPLC/ITMS要低1个数量级。HPLC/IT-MS和CAPLC/QqQ-MS适合检测脱氧、甲基化、乙酰化的修饰核苷组分,而且检测到的核普种类也更多, CAPLC/QqQ-MS在测定某些特定的修饰核苷和定量分析尿液核苷的差异表达时灵敏度高于HPLC/IT-MS。Zhao等[10]利用在线的PBA联用HPLC/TOF-MS与UPLC/TOF- MS分别对核苷进行廓形分析，发现UPLC/TOF/MS分析仪的速度和色谱的准确度都优于HPLC/TOF/MS。

肿瘤患者体内肿瘤特异性的tRNA高度修饰, 尿液修饰核苷的种类千变万化,尿液中修饰核苷的结构鉴定总是很困难，其中部分原因之一在于部分产物化学分子式相同而结构不同，比如尿嘧啶和它的异构体假尿嘧啶。随着LC-MS联用技术的不断发展，至今已能准确对部分核苷进行鉴定。对有标样的修饰核苷，可通过比较测定核苷与标样核苷峰的保留时间、核苷的精确分子量以及MS/MS分析等进行鉴定；对没有标样的修饰核苷，可通过高分辨质谱、二级质谱的分析以及比较标样核苷裂解的规律等进行鉴定。Bullinger等[14]利用LC/ESI-IT-MS分别在MS3及MS6中利用扫描监测模式推导出了核苷代谢物的裂解方式，有4个修饰核苷首次得到了鉴定，它们是2-methylthio-N6-threonyl-carbamoyladenosine,5-methoxycarbonylomethyl-2-thiouridine,2-methylthio-N6-(cis-hydroxyisopentenyl)-adenosine and N6-methyl-N6-threonylcarbamoylo-adenosine。 Kammerer等[15]利用MALDI-TOFMS定性出多种核苷，利用LC/IT-MS得到16种核苷的碎片信息，并以此推导裂解方式。李华雨等[16]利用HPLC-ESI-Q-TOFMS技术准确鉴定了9种有标样和17种无标样的修饰核苷。虽然各种联用技术在使用过程中存在耗时的缺点，由于解决了修饰核苷的鉴定困难的难题，非常有利用价值。

4 LC-MS在修饰核苷作为TM的应用研究

早在l960年，Adams等[17]在研究白血病患者嘌呤和嘧啶分泌水平时发现白血病患者尿中Pseu和m22G水平较正常人增高，认为患者尿中的这两项指标可以作为白血病的肿瘤标记物。此项研究激发了将修饰核苷作为TM的探索，修饰核苷作为具有潜力的TM近年来在代谢组学方面发展迅速，已发现对多种常见肿瘤的诊断、病情监测以及了解疗效和预后起到积极作用[13]，基于LC-MS技术在修饰核苷研究方面的独特优势,已成为修饰核苷作为TM研究的主流技术。Hsu等[6]利用HPLC-ESI-Q-IT-MS技术发现, 乳腺癌患者尿液中胞苷、3-甲基胞苷和次黄苷的排放水平较正常人显著升高，discriminative power分别为58%，58%，62%，认为上述3项核苷是乳腺癌的潜在TM，并建议联合应用多项的修饰核苷标志物以提高乳腺癌的检出率。Struck等[18 ]利用HPLC-ESI-QqQ-MS技术对泌尿生殖器肿瘤患者尿液中的12种修饰核苷进行定量分析，发现其中5种核苷(6-甲基腺苷、次黄嘌呤核苷、 2-甲基鸟苷、3-甲基尿苷和N2，N2-二甲基鸟苷)和健康人相比具有显著性差异(P<0.05)。同样，Daghir等[19]利用LC-MS/MS技术对12个修饰核苷进行了定量分析，认为2-甲基鸟苷和N2，N2-二甲基鸟苷可能是泌尿生殖器肿瘤的潜在TM。Hsu等[20]利用HPLC-MS/MS技术发现腺嘌呤核苷, 胞嘧啶核苷、 3-甲基嘧啶核苷、1-甲基腺苷、 次黄嘌呤核苷 和2-脱氧鸟嘌呤核苷是胃癌和结肠癌诊断的有用标志物，联合检测有助于提高肿瘤的诊断率。Zhang等[21]利用HPLC/ESI-Q-TOF-MS技术在膀胱癌患者尿液中发现1-甲基腺苷和1-甲基次黄嘌呤核苷联合检测时敏感性和特异性分别为92.45%和87.50%。患者术后尿液中2种核苷排放量较术前均显著降低(P<0.01)；同时术后1年复发患者尿液中2种核苷排放量较未复发者显著升高(P<0.01)，认为1-甲基腺苷和1-甲基次黄嘌呤核苷可能是膀胱癌潜在的重要TM，在膀胱癌的诊断、治疗以及预后过程中都具有一定意义。在结、直肠癌也有报道2种修饰核苷浓度与肿瘤患者预后相关。Seidel[5]等研究发现尿液修饰核苷可作为肺癌高危人群的筛查分子标志物。另有学者报道部分尿液修饰核苷的排放水平可作为预测肺癌患者生存期的指标。

5 展望

随着LC-MS技术的发展，无论在核苷代谢产物的定性方面，还是差异代谢物的定量分析方面，LC-MS都有着显著的优势和鲜明的特点，但其本身仍然具有很大的发展空间，且面临着挑战。首先，LC-MS技术虽然检测灵敏度较高，但对痕量物质的鉴定和精确定量,仍还存在不少困难；生物样本间的个体差异导致了不同的基质效应，如何在复杂生物基质条件下对核苷代谢物进行准确的定量分析也是面临的挑战之一；此外，目前LC-MS技术可供搜索用于确定化合物结构的数据库尚有限，不能满足所有复杂多样核苷代谢物研究大的需要。未来将会有更多的新技术、新方法出现，相信LC-MS技术在修饰核苷作为TM的研究领域会不断深入。

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(编校：王冬梅)

Research progress of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC/MSZ

HANG Jian-yingΔ, XU Xiao-hong

(Department of Clinical Laboratory, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

Modified nucleosides are the RNA metabolites,and are well known as potential marker in various types of cancer. They are mainly detected in urine wherein thier concertrations were found elevated in cancer patients. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) technique has been widely used in the field of modified nucleosides analysis, which can not only reach the point of high separating capacity of chromatography but also be provided with high selectivity, sensitivity, and relative molecular mass and structure information of mass spectrum.This review deals with the current status and future trends in the analysis of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC-MS technique.

modified nucleosides; tumor marker; liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); review

浙江省医药卫生科技计划(2016KYA034)

张剑英，通信作者，女，硕士，主管技师，研究方向：肿瘤免疫，E-mail:951094@163.com。

R979.1

A

1005-1678(2016)02-0182-04